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    本發明提供一種高效地獲得高純度之光學活性3-苯基乳酸及4-羥基苯基乳酸之苯丙酮酸還原酵素、對其進行編碼之基因、與使用該等的光學活性3-苯基乳酸及4-羥基苯基乳酸之製造方法。本發明之苯丙酮酸還原酵素包含如下(a)、(b)或(c)之蛋白質：(a)包含序列編號4所記載之胺基酸序列之蛋白質；(b)包含使序列編號4所記載之胺基酸序列置換、缺失、插入1個或多個胺基酸之胺基酸序列，具有苯丙酮酸還原活性，且對苯丙酮酸具有較高的親和性之蛋白質；(c)包含與序列編號4所示之胺基酸序列具有60%以上之同源性之胺基酸序列，具有苯丙酮酸還原活性，且對苯丙酮酸具有較高的親和性之蛋白質。
    公开号:TW201303017A
    申请号:TW101103183
    申请日:2012-01-31
    公开日:2013-01-16
    发明作者:Kazunobu Konishi；Naoki Takaya
    申请人:Asahi Kasei Chemicals Corp；
    IPC主号:C12P7-00
    专利说明:
    苯丙酮酸還原酵素與使用本酵素之光學活性苯基乳酸及4-羥基-苯基乳酸之製造方法
    本發明係關於一種苯丙酮酸還原酵素及其基因、與使用該等之光學活性苯基乳酸及光學活性4-羥基苯基乳酸之製造方法。
    3-苯基乳酸及4-羥基苯基乳酸均係自乳酸菌中單離之抗菌物質(非專利文獻1~4)。
    3-苯基乳酸之抗菌活性不僅廣泛地作用於粽麴菌(Aspergillus ochraceus)、洛克福耳青黴菌(Penicillium roqueforti)、桔青黴(Penicillium citrinum)等黴菌(非專利文獻5)，亦廣泛地作用於單核球增多性李氏菌(Listeria monocytogenes)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌(Escherichia coli)0157等有害之革蘭氏陰性、陽性細菌(非專利文獻1、2、5~7)。根據該廣泛之抗菌活性，暗示3-苯基乳酸有用作食品添加物之可能性。又，其係亦可用作除此以外之醫藥、農藥及其中間體、芳香族生物聚合物．塑膠、液晶等功能性材料、生物適合性(醫療)材料等之有用化合物。
    4-羥基苯基乳酸亦與3-苯基乳酸同樣地來自乳酸菌，故而不僅暗示其有用作食品添加物之可能性，亦期待其作為除此以外之用途中之抗菌性添加物、進而醫藥、農藥及其中間體。
    關於該等化合物之製造方法，光學活性3-苯基乳酸係於大多數之報告中嘗試藉由有機化學合成而加以製造(專利文獻1)，但就環境問題或成本之觀點而言，期待不使用此種化學物質的新穎之合成方法。進而，4-羥基苯基乳酸係尚未確立高純度地大量生產之技術，現狀為利用有機化學合成，以消旋體為主要產物，即以D體及L體混合存在之狀態作為試驗試劑而少量市售，殷切希望生成效率更高之合成方法。
    作為該等課題之潛在性解決方法，可列舉不使用觸媒或有機溶劑等化學物質而能夠大量生產所需化合物之利用微生物培養或酵素之光學活性3-苯基乳酸或4-羥基苯基乳酸之合成方法。
    作為3-苯基乳酸之生產菌，已知子囊菌白地絲黴菌(Geotrichum candidum)(非專利文獻2)、丙酸生產細菌丙酸菌(Propionibacterium freudenreichii)(非專利文獻8)、各種乳酸菌(非專利文獻5、9~11)。
    然而，關於與3-苯基乳酸之生產有關之酵素的分子級別上之研究，於2008年僅使乳酸桿菌SK007(Lactobacillus.sp SK007)之D,L-乳酸脫氫酶(D,L-Lactate dehydrogenase)純化(非專利文獻12)。又，作為選殖對於預想為3-苯基乳酸之前驅物之苯丙酮酸具有酵素活性之酵素的基因之例子，僅存在如下兩例：來自胚芽乳酸桿菌SK002(Lactobacillus plantarum SK002)之重組D,L-乳酸脫氫酶(D,L-Lactate dehydrogenase)(非專利文獻13)，來自埃特裏根瘤菌CFN 42(Rhizobium etli CFN 42)之重組乙醛酸還原酵素/羥基丙酮酸還原酵素(Glyoxylate reductase/Hydroxypyruvate reductase)(非專利文獻16)，但尚不明確該等是否參與3-苯基乳酸之生產。
    又，於專利文獻2及3中存在光學活性3-苯基乳酸生產菌之報告，但該等係R體與S體混合存在，因此並不理想。
    於專利文獻4中報告有：PF1022物質生產菌之絲狀真菌無孢菌群(Mycelia sterilia)(FERM BP-2671)產生之酵素作用於苯丙酮酸而將其還原並轉變為(R)-2-羥基-3-苯基丙酸。
    然而，目前仍無法高效地獲得高純度之光學活性3-苯基乳酸。
    如上所述，尚未確立可大量地獲得高純度之光學活性3-苯基乳酸及4-羥基苯基乳酸的製造方法，迫切期待其之開發。 先前技術文獻專利文獻
    專利文獻1：日本專利特開2003-192633號公報
    專利文獻2：日本專利特開平9-37792號公報
    專利文獻3：日本專利特開2000-300284號公報
    專利文獻4：國際公開2001/81563號手冊 非專利文獻
    非專利文獻1：Lavermicocca,P.；Valerio,F.；Evidente,A.；Lazzaroni,S.；Corsetti,A.；Gobbetti,M.,Appl.Environ.Microbiol.2000 66 4084-4090。
    非專利文獻2：Dieuleveux,V.；Van Der Pyl,D.；Chataud,J.；Gueguen,M.,Appl.Environ.Microbiol.1998 64 800-803。
    非專利文獻3：Paola La et al.,"Purification and characterization of novel antifungal compounds from the sourdough Lactobacillus plantarum strain 21B",Applied and Environmental Microbiology(2000),66(9),4084-4090.。
    非專利文獻4：Wanmeng Mu et al.,"Production of 4-hydroxyphenyllactic acid by Lactobacillus sp.SK007" fermentation Journal of Bioscience and Bioengineering(2010),109(4),369-371。
    非專利文獻5：Ohhira,I.；Kuwaki,S.；Morita,H.；Suzuki,T.；Tomita,S.；Hisamatsu,S.；Sonoki,S.；Shinoda,S.,Biocontrol Sci.2004 9 77-81。
    非專利文獻6：Dieuleveux,V.；Gueguen,M.；J.Food Prot.1998 61 1281-1285。
    非專利文獻7：Dieuleveux,V.；Lemarinier,S.；Gueguen,M.；Int.J.Food Microbiol.1998 40 177-183。
    非專利文獻8：Thierry,A.；Maillard,M.,2002 82 17-32。
    非專利文獻9：Strom,K.；Sjogren,J.；Broberg,A.；Schnurer,Appl.Environ.Microbiol.2002 68 4322-4327。
    非專利文獻10：Magnusson,J.；Strom,K.；Roos,S.；Sjogren,J.；Schnurer,Microbiol.Lett.2003 219 129-135。
    非專利文獻11：Valerio,F.；Lavermicocca,P.；Pascale,M.；Visconti,A.,Microbiol.Lett.2004 233 289-295。
    非專利文獻12：Li,X.；Pan,.Mu,W.& Zhang,T.(2008).,Journal of Agricultural and Food Chemistry,56 7 2392-399。
    非專利文獻13：Jianghua,J.；Wanmeng,M.；Tao,Z.；Bo.；,Appl.Biochem.Biotechnol.2009(出版中)。
    非專利文獻14：Ishikura,Y.；Tsuzuki,S.；Takahashi,O.；Tokuda,C.；Nakanishi,R.；Shinoda,T.；Taguchi,H.,J.Biochem.2005 138,741-749。
    鑒於上述問題及實際狀況，本發明欲提供一種高效地獲得高純度之光學活性3-苯基乳酸及4-羥基苯基乳酸之苯丙酮酸還原酵素及對其進行編碼之基因、與利用該等的光學活性3-苯基乳酸及4-羥基苯基乳酸之合成方法。
    本發明者不僅對已知之乳酸菌，亦對範圍更廣之微生物反覆進行試誤，結果發現由葡萄糖大量生產光學活性苯基乳酸的新穎之酵母菌。並且，亦發現：於大量生產光學活性苯基乳酸時，該酵母菌具有尤其以苯丙酮酸作為基質並對其具有較高之親和性且發揮作用而專門生成光學活性苯基乳酸的新穎且特殊之苯丙酮酸還原酵素(以下亦稱為「PPR」)，且該PPR為新穎之酵素。進而發現：藉由使對該新穎且特異之PPR進行編碼之基因(以下亦稱為「ppr基因」)選殖化並使用其轉形體，可於基因工程方面製造特異且新穎之PPR。又，發現：利用該轉形體，亦可由葡萄糖獲得光學活性苯基乳酸。
    進而，本發明者發現：本發明之PPR對於4-羥基苯丙酮酸亦具有親和性且以4-羥基苯丙酮酸作為基質，因此可選擇性地生產高純度之光學活性4-羥基苯基乳酸，具體而言高純度之D-4-羥基苯基乳酸。並且，發現：即便使用可廉價且穩定地獲得之D-葡萄糖作為其原材料(基質)，亦可確立能夠大量生產之高純度之光學活性4-羥基苯基乳酸的製造方法。
    另外，本發明之PPR為與專利文獻1所記載之酵素僅具有24%之同源性，且與先前已知之酵素亦僅具有約40%左右之同源性的新穎之酵素。並且，如後述實施例所示般，本發明之PPR不屬於現存之HPPR或GRHPR家族，亦存在形成新穎之家族者。並且，本發明之PPR與先前之PPR相比酵素活性提高數十倍，產業上之可利用性亦較高。又，明白：生產此種特異之酵素，且由葡萄糖產生光學活性苯基乳酸之本發明之新穎酵母菌亦為重要之遺傳資源。
    即，本發明係關於以下之發明者。
    [1]一種多核苷酸，其係對以苯丙酮酸作為基質而生成D-苯基乳酸之苯丙酮酸還原酵素進行編碼者，且選自由如下多核苷酸所組成之群中：(a)包含序列編號5所示之鹼基序列之多核苷酸；(b)於嚴格條件下與包含序列編號5所示之鹼基序列之多核苷酸雜交之多核苷酸；(c)包含與含有序列編號5所示之鹼基序列之多核苷酸具有60%以上之同源性的鹼基序列之多核苷酸；(d)包含序列編號6、7或8所示之鹼基序列之多核苷酸；(e)對序列編號4所示之胺基酸序列進行編碼之多核苷酸；(f)對使序列編號4所示之胺基酸序列缺失、置換或加成1個或多個胺基酸之胺基酸序列進行編碼之多核苷酸；及(g)對與序列編號4所示之胺基酸序列具有60%以上之同源性的胺基酸序列進行編碼之多核苷酸。
    [2]一種苯丙酮酸還原酵素，其係以苯丙酮酸作為基質而生成D-苯基乳酸者，且含有如下胺基酸序列中之任一者：(a)序列編號4所示之胺基酸序列；(b)使序列編號4所示之胺基酸序列缺失、置換或加成1個或多個胺基酸之胺基酸序列；或(c)與序列編號4所示之胺基酸序列具有60%以上之同源性之胺基酸序列。
    [3]一種重組載體，其含有如上述[1]之核苷酸。
    [4]一種轉形體，其含有如上述[3]之重組載體。
    [5]如上述[4]之轉形體，其宿主為微生物。
    [6]如上述[5]之轉形體，其中上述微生物為大腸桿菌、或者苯丙胺酸或酪胺酸生產性重組微生物。
    [7]一種D-苯基乳酸或D-4-羥基苯基乳酸之製造方法，其特徵在於：使用包含如下(a)、(b)或(c)之蛋白質之苯丙酮酸還原酵素，以苯丙酮酸或4-羥基苯丙酮酸作為基質而生成D-苯基乳酸或D-4-羥基苯基乳酸並將其回收：(a)包含序列編號4所示之胺基酸序列之蛋白質；(b)包含使序列編號4所示之胺基酸序列缺失、置換或加成1個或多個胺基酸之胺基酸序列之蛋白質；或(c)包含與序列編號4所示之胺基酸序列具有60%以上之同源性的胺基酸序列之蛋白質。
    [8]如上述[7]之D-苯基乳酸或D-4-羥基苯基乳酸之製造方法，其中上述苯丙酮酸還原酵素之反應條件為反應溫度20~40℃、pH值6~7。
    [9]一種D-苯基乳酸或D-4-羥基苯基乳酸之製造方法，其特徵在於：使用含有對包含如下(a)、(b)或(c)之蛋白質之苯丙酮酸還原酵素進行編碼之基因的微生物並加以培養，由微生物基質生成D-苯基乳酸或D-4-羥基苯基乳酸並將其回收：(a)包含序列編號4所示之胺基酸序列之蛋白質；(b)包含使序列編號4所示之胺基酸序列缺失、置換或加成1個或多個胺基酸的胺基酸序列之蛋白質；或(c)包含與序列編號4所示之胺基酸序列具有60%以上之同源性的胺基酸序列之蛋白質。
    [10]如上述[9]之D-苯基乳酸或D-4-羥基苯基乳酸之製造方法，其中上述微生物為威克酵母屬酵母或將其作為母株之變異株、或者如上述[4]或[5]之轉形體。
    [11]如上述[9]之D-苯基乳酸或D-4-羥基苯基乳酸之製造方法，其中上述微生物基質為選自D-葡萄糖、L-苯丙胺酸、L-酪胺酸、苯丙酮酸及4-羥基苯丙酮酸中之1種以上之基質。
    [12]如上述[10]之D-苯基乳酸或D-4-羥基苯基乳酸之製造方法，其中威克酵母屬酵母為螢光威克酵母(Wicherhamia fluorescens)。
    [13]一種微生物，其係命名為螢光威克酵母TK1並作為FERMAP-22048寄存。
    根據本發明，可高效地獲得高純度之光學活性3-苯基乳酸及4-羥基苯基乳酸。1.本發明之苯丙酮酸還原酵素
    (1)本發明之PPR之酵素學性質
    (2)本發明之PPR之胺基酸序列及對其進行編碼之基因
    (3)本發明之PPR之獲取方法 2.光學活性3-苯基乳酸之製造方法
    (1)利用本發明之PPR之光學活性苯基乳酸之製造方法
    (2)利用具有對本發明之PPR進行編碼之基因之微生物的光學活性3-苯基乳酸之製造方法 3.光學活性4-羥基苯基乳酸之製造方法
    (1)利用本發明之PPR之光學活性4-羥基苯基乳酸之製造方法
    (2)利用具有對本發明之PPR進行編碼之基因之微生物的光學活性4-羥基苯基乳酸之製造方法 <1. 本發明之苯丙酮酸還原酵素>
    本發明之苯丙酮酸還原酵素係新穎之酵素，其具有以下之酵素學性質與胺基酸序列以及對其進行編碼之基因。該PPR較佳為形成同型二聚體者。
    根據本發明之PPR，可獲得高純度之D-苯基乳酸或D-4-羥基苯基乳酸。由於可直接生成光學活性苯基乳酸或4-羥基苯基乳酸，故而亦可藉由省略使如先前之有機合成物般大致等量地混合存在之D體L體各自分離或去除任一者之分離純化步驟而改善作業效率，並且高純度化亦較容易。由於容易獲得經高純度化之光學活性苯基乳酸及羥基苯基乳酸，故而可容易地用於各種用途，尤其是醫藥、食品添加物、農藥等要求有高純度化之技術領域中。 (1)酵素學性質 [作用]
    本發明之PPR係以苯丙酮酸及4-羥基苯丙酮酸作為基質並對其具有較高親和性且發揮作用而生成光學活性苯基乳酸(D-3-苯基乳酸)及4-羥基苯基乳酸(D-4-羥基苯基乳酸)者。較佳為對映選擇性地生成D-3-苯基乳酸及D-4-羥基苯基乳酸。

    又，基質並不限定於苯丙酮酸及羥基丙酮酸，除此以外較佳為使乙醛酸還原。其中，以苯丙酮酸作為基質時，kcat/Km值最大。
    又，作為輔酶，可利用NADH(還原態之菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸)及NADPH(還原態之菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)，但對於NADPH之特異性較高。
    較理想為苯丙酮酸及NADPH之kcat/Km值(特異度常數)為300~500 s-1mM-1(Km值0.40±0.07 mM)之酵素，但並不特別地限定於該特異度常數。再者，特異度常數kcat/Km值表示酵素使基質轉變為生成物時之效率。
    作為此時之測定條件，可列舉如下之方法。使用50 mM之磷酸緩衝液(pH值6.5)、2 mM之苯丙酮酸、0.1 mM之NADPH作為酵素反應液，於其中添加酵素並於溫度25℃下進行反應，使用紫外可見分光光度計(340 nm)進行定量。NADPH對340 nm之波長之吸收的莫耳吸光係數為6.2 mM-1．cm-1。
    又，較佳為利用作作為基質之苯丙酮酸1 mol及作為輔酶之NADPH 1 mol生成光學活性苯基乳酸(D-3-苯基乳酸)者。
    此時之D-3-苯基乳酸：L-3-苯基乳酸之莫耳比較佳為100~90：0~10，更佳為100~95：0~5，進而較佳為100~98：0~2，進而，較佳為光學純度99%以上之D-3-苯基乳酸(光學活性苯基乳酸)。
    又，該反應較佳為不可逆反應。此處，所謂不可逆反應，係指於以D-3-苯基乳酸、L-3-苯基乳酸、NAD+、NADP+之組合作為基質之情形時，不進行酵素反應或未檢測出苯丙酮酸。 [基質]
    以選自4-羥基苯丙酮酸、3-苯丙酮酸、乙醛酸及羥基丙酮酸之1種以上作為原料(基質)，並觸發還原反應。再者，較理想為不以丙酮酸及酸草醯基乙酸作為基質。 [最佳反應pH值]
    以三羥甲基胺基甲烷-氯化氫(Tris-HCl)緩衝液(pH值7~8)及磷酸緩衝液(pH值5~7)之緩衝液調整至各pH值(25℃)後，除pH值以外於上述[作用]所記載之測定條件下求出酵素活性，於此情形時，在pH值6~7、尤其是pH值6.5~7下顯示較高之活性。 [反應溫度]
    於pH值6.5、20~40℃之條件下顯示良好之苯丙酮酸還原反應。 [分子量]
    於SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(Lammli等方法)之測定中，本發明之PPR顯示分子量30,000~50,000道耳頓、尤其是分子量40,000道耳頓。
    又，於凝膠過濾法之測定中，顯示分子量70,000~90,000、尤其是分子量80,000。
    於此時之凝膠過濾之測定分析中，將酵素供給至預先經溶出緩衝液(10%之甘油、1 mM之二硫蘇糖醇(DTT，DL-Dithiothreitol)、20 mM之磷酸緩衝液、0.15 mM之NaCl pH值7)平衡化之Superose凝膠過濾管柱(Superose 6 10/300)中，利用管柱容量之1倍之溶出緩衝液使其溶出。
    作為標準蛋白質，使用牛血清白蛋白(M.W.67,000)、胰凝乳蛋白酶原(M.W.25,000)、α-澱粉酶(M.W.45,000)、β-澱粉酶(M.W.200,000)。 [金屬離子及抑制劑之影響] 2)金屬離子及抑制劑之影響
    藉由選自Cu2+、Zn2+、Fe2+、WO2-、Hg2+之1種以上之金屬離子，PPR活性受到強烈抑制(抑制90~100%左右)。藉由選自Ni2+、Co2+之1種以上之金屬離子，其受到較強抑制(抑制30~40%左右)。藉由選自Mn2+、Mg2+、Ca2+、Mo2+之1種以上之金屬離子，其大致不受抑制或完全不受抑制(抑制15~0%左右)。
    藉由選自Tween 80(Tween：註冊商標)、2-巰基乙醇(2-mercaptethanol)之1種以上之抑制劑，其幾乎不受抑制(30~50%)。藉由選自TritonX-100(tritonX)、乙二胺四乙酸(EDTA)之1種以上抑制劑，其大致不受抑制(10~20%左右)。
    再者，除以各物質成為1 mM之方式同時添加金屬離子及抑制劑均以外，於上述[作用]所記載之測定條件下求出酵素活性。 [部分胺基酸序列]
    本發明之PPR較佳為至少具有以下之N末端胺基酸序列及/或內部胺基酸序列之部分胺基酸序列者。再者，該部分胺基酸序列亦可置換、缺失、插入1個或多個胺基酸。 [部分胺基酸序列：N末端胺基酸序列]
    N末端側之胺基酸殘基之序列為N末端側之MKKPQVLILGRI之12胺基酸殘基之序列(序列編號1)。
    再者，N末端側之胺基酸殘基之序列可利用公知之方法(Edman,P.(1950)Acta Chem.Scand.4：283-293)而獲得。作為一例，可藉由如下方式決定：利用SDS-聚丙烯醯胺電泳法使酵素泳動，使所獲得之酵素電性移動至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜等上，其後利用蛋白質定序儀進行分析。 [部分胺基酸序列：內部胺基酸序列]
    胰蛋白酶消化肽之胺基酸殘基之序列為具有NIQAIYGNWGGLASFGGFK之19胺基酸殘基的序列(序列編號2)、及VAFAALDVFEEEPFIHPGLIGR之22胺基酸殘基的序列(序列編號3)。
    再者，胰蛋白酶消化肽只要利用公知之方法(Shimizu,M.,et al.(2009)Proteomics 9,7-19)獲得即可。作為一例，係將於SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis，十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳)中泳動之經純化之本發明之PPR自凝膠中切斷，利用胰蛋白酶(溫度36~38℃、pH值8~9、4~18小時)進行凝膠內消化而獲得。又，可利用市售品之胰蛋白酶消化肽試劑盒進行，具體而言可列舉Trypsin Profile IGD Kit：凝膠內消化試劑盒(SIGMA-ALDORICH公司)等。 (2)本發明之PPR之胺基酸序列及對其進行編碼之基因(鹼基序列)
    本發明之PPR包含以下(a)、(b)及(c)之蛋白質。
    (a)包含序列編號4所示之胺基酸序列之蛋白質。
    (b)包含使序列編號4所示之胺基酸序列置換、缺失或加成1個或多個胺基酸之胺基酸列，具有苯丙酮酸還原活性，且對於苯丙酮酸具有較高的親和性之蛋白質。
    (c)包含與序列編號4所示之胺基酸序列具有60%以上之同源性之胺基酸序列，具有苯丙酮酸還原活性，且對於苯丙酮酸具有較高的親和性之蛋白質。
    對本發明之序列編號4所示之PPR之胺基酸序列與已知之苯丙酮酸還原酵素之胺基酸序列的同源性進行比較，結果暗示：與任何已知者之同源性均為約20%~50%左右，極低，本發明之PPR為新穎之酵素，且形成新酵素群。又，本發明之ppr基因由於包含對本發明之PPR進行編碼之基因，故而為新穎之基因。
    於本發明中，胺基酸序列及鹼基序列之同源性可藉由李卜曼-皮爾遜法(Lipman-Person法)(Science,227,1435,(1985))等公知之演算法進行計算，又，因此可藉由比較序列而進行判定。具體而言，使用遺傳資訊處理軟體Genetyx-ver 8.1(軟體開發：GENETYX公司)之同源性解析(Search homology)程式之檢索同源性或最大匹配程式，可算出同源性。例如，藉由將比較單元大小(Unit size to compare)(ktup)設為2進行解析而算出。
    又，於本發明中，轉錄起始區域為包含啟動子及轉錄起點之區域，核糖體結合部位係相當於與起始密碼子一起形成轉譯起始控制區域之Shine-Dalgarno(SD)序列(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74,5463(1974))的部分。
    此處，所謂使序列編號4所示之胺基酸序列置換、缺失或加成1個或多個胺基酸之胺基酸序列，係指分別與序列編號4於功能上等價之胺基酸序列，為置換、缺失或加成1個或多個、較佳為1~6個、更佳為1~3個胺基酸之胺基酸序列，係指依然具有苯丙酮酸還原活性，且對於苯丙酮酸保持較高的親和性之序列。又，加成亦包括1個或多個、較佳為1~6個、更佳為1~3個胺基酸向兩末端之加成。
    所謂上述功能上等價之胺基酸，只要為至少具有苯丙酮酸還原活性及4-羥基苯丙酮酸還原活性之酵素即可，亦可進而具有附加性質。進而，較佳為對於苯丙酮酸具有較高之親和性。又，較佳為具有與由序列編號5所示之ppr基因所編碼之蛋白質實質上相同之功能，具體而言上述本發明之PPR之功能。
    此處，所謂具有苯丙酮酸還原活性及4-羥基苯丙酮酸還原活性，係指如上述流程1及2般，使苯丙酮酸及4-羥基苯丙酮酸分別形成為D-3-苯基乳酸及D-4-羥基苯基乳酸，關於該等活性之程度，只要發揮其功能，則功能之高低並無特別限制，即不僅可為與序列編號4所示之蛋白質相同程度者，亦可為與其相比較高或較低者。
    又，所謂附加性質，可列舉與包含序列編號4所示之胺基酸序列之蛋白質相比穩定性優異之性質、反應溫度或pH值不同或大範圍之性質等。
    又，於序列編號4所示之胺基酸序列中，較佳為具有60%以上、較佳為65%以上、更佳為70%以上、更佳為75%以上、更佳為80%以上、更佳為85%以上、進而較佳為90%以上、進而較佳為95%以上、尤佳為98%以上之同源性的胺基酸序列。
    如下述實施例所示般，藉由發現本發明之PPR而亦發現新穎之酵素群，因此只要為如包含本發明之序列編號4所示之胺基酸序列之蛋白質所述般具有苯丙酮酸還原活性且至少具有對於苯丙酮酸之較高的親和性之功能上等價之酵素，且為於60%左右以上之同源性範圍內者，則預測為包含於該新穎之酵素群中。通常，由於顯示60%以上之相同性之蛋白質大多具有類似之酵素之特異性，故而可認為顯示此種相同性者包含於相同酵素群中。
    本發明之ppr基因係對包含序列編號4所示之胺基酸序列之蛋白質或包含與該胺基酸序列於功能上等價之胺基酸序列之蛋白質進行編碼的基因，亦包含如下(a)~(d)之多核苷酸。其中，較佳為如下(a)~(d)。
    (a)包含序列編號5所示之鹼基序列之多核苷酸。
    (b)與包含序列編號5所示之鹼基序列之多核苷酸於嚴格條件下雜交，且對具有苯丙酮酸還原活性之蛋白質進行編碼之多核苷酸。
    (c)包含與序列編號5所示之鹼基序列具有60%以上之同源性之鹼基序列，且具有苯丙酮酸還原活性，對與苯丙酮酸具有較高的親和性之蛋白質進行編碼之多核苷酸。
    (d)包含序列編號6、7或8所示之鹼基序列，且具有苯丙酮酸還原活性，對與苯丙酮酸具有較高的親和性之蛋白質進行編碼的多核苷酸。
    於序列編號5所示之鹼基序列中，較佳為具有較佳為65%以上、更佳為70%以上、更佳為75%以上、更佳為80%以上、更佳為85%以上、進而較佳為90%以上、進而較佳為95%以上、尤佳為98%以上之同源性的鹼基序列。
    即，本發明之ppr基因為包含含有如下聚核苷酸之基因者：即便為藉由變異劑處理、無規變異、特定部位突然變異、缺損或插入等對序列編號5之鹼基序列所示之多核苷酸(DNA等)部分性地改變鹼基序列者，亦使該等DNA變異體與序列編號5之鹼基序列所示之DNA於嚴格條件下雜交，且對至少具有苯丙酮酸還原活性之蛋白質進行編碼。例如可列舉置換、缺失或加成有1個或多個(例如2~3個)鹼基序列之鹼基序列等。又，加成亦包含向兩末端之加成。此處，「1個或多個」係指1~6個，較佳為1~3個左右。
    此處，所謂「嚴格條件」，例如可列舉Molecular cloning-a laboratory manual,2nd edition(Sambrook et al,1989)中所記載之條件。即，可列舉：於含有6 XSSC(1 XSSC之組成：0.15 M之氯化鈉、0.015 M之檸檬酸鈉、pH值7.0)、0.5%之SDS、5 X之Denhardt及100 mg/mL之鯡魚精子DNA的溶液中，與探針共同於65℃下恆溫8~16小時而使其雜交之條件等。
    又，上述(b)~(d)所示之基因例如與(a)所示之基因相比，亦可具有mRNA(信息核糖核酸)之表現量較多、其mRNA之穩定性較高、轉譯之蛋白質之穩定性優異等附加性質。
    又，於該等(a)~(d)基因之上游，可結合轉錄起始控制區域、轉譯起始控制區域或分泌訊號區域中之任意1個以上區域。
    再者，於本發明中，轉錄起始區域為包含啟動子及轉錄起點之區域，核糖體結合部位為相當於與起始密碼子共同形成轉譯起始控制區域之Shine-Dalgarno(SD)序列(Proc.Nalt.Acad.Sci.USA 74,5463(1974))之部位。
    又，於本發明中，所謂基因之上游或下游，並非自複製起點起之位置，上游表示作為對象而捕捉之基因或與區域5'側連接之區域，另一方面，下游表示作為對象而捕捉之基因或與區域3'側連接之區域。 (3)本發明之PPR(苯丙酮酸還原酵素)之獲取方法
    (i)本發明之PPR可藉由威克酵母屬(Wickerhamia)酵母或其變異株、或導入對上述PPR進行編碼之基因或其片段之轉形體(較佳為微生物)而生產、獲取。
    上述威克酵母屬酵母係子囊菌酵母，且只要為具有對上述酵素PPR進行編碼之基因者，則並無特別限定，較佳為具有由苯丙酮酸生產D-3-苯基乳酸之功能及/或由D-葡萄糖經苯丙酮酸生產光學活性苯基乳酸(D-3-苯基乳酸)之功能者。
    作為該酵母，例如可列舉螢光威克酵母、及具有與其相同之菌學性質及生理學性質之菌。
    進而，可列舉螢光威克酵母TK1(FERM AP-22048)菌株(以下亦稱為「酵母菌TK1」)及與其相同之菌、及其變異株。此處，所謂變異株，可藉由紫外線、電離輻射、亞硝酸、亞硝基胍、甲磺酸乙酯等處理等公知之方法獲得野生株酵母菌TK1株。再者，變異株亦包含使源自野生株之變異株進而變異者。
    以下，表示上述螢光威克酵母TK1(FERM AP-22048)菌株之菌學性質及生理學性質。 (a)26S rDNA-D1/D2鹼基序列
    序列編號9所示之鹼基序列。 (b)形態學特徵
    形狀：檸檬形、卵形、長卵形。
    增殖形式：增殖係藉由兩極出芽，出芽部位增寬而形成偽菌絲。
    胞子形成：於子囊中形成運動帽形之子囊胞子。 (c)生理生物化學性狀
    糖醱酵性：D-葡萄糖(+)、蔗糖(+)、D-半乳糖(W)、麥芽糖(-)。
    碳源同化性：D-葡萄糖(+)、蔗糖(+)、D-半乳糖(+)、麥芽糖(-)、肌醇(-)。
    氮源同化性：硝酸鹽(-)。
    再者，上述酵母菌TK1係於2007年11月選取日本茨城縣築波市內之環境中之40種土壤或水，適當稀釋後塗佈於YPD瓊脂培養基(Yeast Extract Peptone Dextrose Agar，酵母浸出粉腖葡萄糖瓊脂培養基)(參照下述實施例1)中。於28℃下培養2~4天後，將出現之菌落適當稀釋，其後接種於新YPD瓊脂培養基中，反覆進行上述操作而進行純粹分離。
    進而，將分離之菌株1白金耳植菌於添加有D-葡萄糖之MM液體培養基(參照表1)中，於28℃下培養2至4天。利用公知之方法獲取各菌株之培養上清液，並利用公知之測定法(例如，ODS(Octadecyl silane chemically bonded to silica gel，填料矽膠鍵結碳十八矽烷)液體色譜分析、氣體色譜分析等)測定該培養上清液中之光學活性苯基乳酸，挑選光學活性苯基乳酸之生產量良好者，獲得自土壤中收取之本菌株TK1。
    進而，根據本菌株之菌學性質及生理學性質，推測其屬於螢光威克酵母，並將本菌株命名為W.fluorescens TK1株(螢光威克酵母TK1株)。該螢光威克酵母TK1株由於上述情況而作為新穎之微生物於2010年12月13日於〒 305-8566茨城縣築波市東1-1-1築波中心中央第6、獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物寄存中心(IPOD)中寄存為Wickerhamia fluorescens TK1(FERM AP-22048)。
    由酵母菌TK1菌株生產本發明之PPR時，只要植菌於通常之酵母培養用培養基中並於適當溫度下進行培養即可。自培養液中之本發明之PPR之生成可依據常規方法而進行。具體而言，可對培養液進行離心分離而去除菌體後，使用公知之酵素分離純化法自無細胞萃取液中濃縮或回收。作為分離純化法，例如可列舉：凝膠過濾層析或超濾膜等過濾法、以及藉由添加硫酸銨之酵素沈澱法等。
    本發明之PPR如上所述般可由自然界中獲得，亦可自上述微生物(較佳為子囊酵母菌)之染色體DNA中選殖其基因，大量生產、回收該PPR。
    作為ppr基因之選殖方法，例如可採用如下方法：利用連結於可使該基因穩定地增幅之DNA載體上之方法或導入可維持於該基因上之染色體DNA上之方法等，使對本發明之PPR進行編碼之DNA穩定地增幅，進而將該基因導入可使其穩定且高效地表現之宿主中，從而生產本發明之PPR。
    再者，本發明之ppr基因可利用公知之方法(例如，參照「Sambrook,J.,Fritch,E.F.,and Maniatis,T.(1989)in Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Vol.2,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY」)而獲取。作為一例，自PPR產生菌株中萃取基因組DNA，利用適當之限制酵素切斷後，使用噬菌體載體製作包含PPR產生菌株之基因組DNA之基因庫。或者，自PPR產生菌株中萃取全RNA，利用以T重複寡核苷酸(Oligo dT)作為引子之逆轉錄酵素反應製備與mRNA對應之cDNA(互補DNA)後，使用噬菌體載體製作包含PPR產生菌株之cDNA之基因庫。
    將如上所述之N末端胺基酸序列及內部胺基酸序列均合成適當之引子，使用其進行以來自PPR產生菌株之基因組DNA或cDNA作為範本之聚合酶鏈反應(PCR，polymerase chain reaction)，將ppr基因之DNA片段增幅。使用該DNA片段作為探針，進行基因組基因庫或cDNA基因庫之篩選。以此種方式，可將ppr基因之全區域或表現所必需之區域單離。決定該等之DNA片段之鹼基序列後，藉由PCR等方法於轉譯起始密碼子之上游及轉譯終止密碼子之下游導入適合之限制酵素切斷部位，可獲得含有僅包含本發明之ppr基因之多肽之基因片段。 [重組載體及其製作方法]
    又，根據本發明，可使用含有對PPR進行編碼之多核苷酸或ppr基因之重組載體。藉此，可獲得轉形體，並藉由該轉形體之培養等而於基因工程方面製造PPR。
    本發明之重組載體之成型順序及方法可使用基因工程領域中慣用者(Sambrook,J.,Fritch,E.F.,and Maniatis,T.(1989)in Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Vol.2,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY)。
    作為可用於本發明中之載體，可列舉：組入宿主染色體DNA中者，或使具有可自我複製之自主複製序列之載體以質體狀態存在於宿主細胞內者。作為該質體載體，例如於以大腸桿菌為宿主之情形時，可列舉pUC18、pBR322(TAKARA BIO)等，於使用棒狀桿菌之情形時，可列舉pPK4等。再者，存在於宿主細胞內之基因之副本數可為1個或複數個之任一者。
    關於本發明之重組載體，例如，以可進行動作之方式分別於對PPR進行編碼之多核苷酸序列之上游連結啟動子(控制區域)，並於下游連結終止子，有時可藉由以可進行動作之方式連結基因標記物及/或其他控制序列而製作。
    啟動子或終止子向本發明之基因之連結及表現單元向載體之插入可利用公知之方法(Sambrook,J.,Fritch,E.F.,and Maniatis,T.(1989)in Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Vol.2,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY)而進行。
    此處，本發明中所使用之啟動子及終止子並無特別限定，例如可列舉：3-磷甘油酸激酶、戊二醛-3-磷酸脫氫酶等糖酵解系酵素基因之控制序列；色胺酸合成酶等胺基酸合成系酵素基因之控制序列；澱粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶等水解酵素基因之控制序列；硝酸還原酶、乳清苷-5'-磷酸脫水酶、醇脫水酶等氧化還原酵素基因之控制序列等。再者，所謂各控制序列，係指於各控制區域中可發揮所需功能之多核苷酸。
    再者，亦可使本發明之基因與對其他蛋白質之轉譯區域進行編碼之外來基因連結而表現為融合蛋白質。
    又，關於基因標記物向重組載體之導入，例如可藉由如下方式進行：利用PCR法於控制序列中導入適當之限制酵素切斷部位，將其插入質體載體後，連結耐藥性基因及/或營養缺陷型互補基因等選擇標記物基因。
    選擇標記物可根據轉形體之選擇方法而適當選擇，例如可使用編碼耐藥性之基因或彌補營養缺陷型之基因。
    作為該耐藥性基因，可列舉針對得黴素、免賴得(Benomyl)、寡黴素、潮黴素、G418、博萊黴素、草胺膦、安比西林、康黴素等藥物之基因。
    又，作為該彌補營養缺陷型之基因，可列舉argB基因、pyr4基因、trpC基因、TRP1基因、niaD基因、LEU2基因、URA3基因等。 [導入有本發明之重組載體之轉形體]
    根據本發明，可使用以上述方式獲得之重組載體使宿主(較佳為微生物)轉形而獲得轉形體。
    所使用之宿主只要為可用作基因重組之宿主者，較佳為微生物，則並無特別限定。作為可使用之宿主，例如可列舉任意之細菌類或真菌類等微生物，其中較佳為使用大腸桿菌、棒狀桿菌、乳酸菌、放線菌、酵母、絲狀真菌，具體而言屬於大腸桿菌(Escherichia)屬、假單孢菌(Pseudomonas)屬、黃桿菌(Flavobacterium)屬、[芽孢]桿菌(Bacillus)屬、鋸桿菌(Serratia)屬、棒狀桿菌(Corynebacterium)屬、短桿菌(Brevibacterium)屬、土壤桿菌(Agrobacterium)屬、乙酸桿菌(Acetobacter)屬、葡萄桿菌(Gluconobacter)屬、乳酸桿菌(Lactobacillus)屬、鏈球菌(Streptococcus)屬或鏈黴菌(Streptomyces)屬之微生物及該等之變異株等。就重組較容易之方面而言，更佳為大腸桿菌或其變異株。
    此時，該等微生物較佳為以容易生產光學活性苯基乳酸或4-羥基苯基乳酸之方式實施基因之置換、插入、缺失、不活化等變異的重組微生物，作為該重組微生物，較佳為苯丙胺酸產生菌(苯丙胺酸生產性重組微生物)及酪胺酸產生菌(酪胺酸生產性重組微生物)。
    作為使如上所述之基因產生變異之方法，例如可列舉：重組PCR法[PCR Technology,Stockton press(1989)]、部分特異性移位法[Kramer,W.and Frits,H.,J.Methods in Enzymology,154,350(1987)]、使用藉由SOE(splicing by overlap extension，重疊延伸拼接)-PCR法[Gene,77,61,(1987)]所製備之DNA片段的雙重交叉法、進行化學藥物處理(N-甲基-N'-亞硝基胍、亞硝酸等)之方法、化學合成目標基因之方法等。
    又，苯丙胺酸生產菌只要為使用公知技術以可大量生產L-苯丙胺酸(較佳為以D-葡萄糖作為基質而大量生產L-苯丙胺酸)之方式使基因變異之微生物即可。作為該苯丙胺酸生產性重組微生物，可列舉：藉由含有對解除反饋抑制之3-脫氧-D-阿拉伯庚糖酸-7-磷酸合成酶及預苯酸脫氫酶進行編碼之DNA片段的重組載體而轉形之缺失tryR基因及tyrA基因的大腸桿菌屬微生物等。
    作為更具體之微生物，例如可列舉：ATCC31882株、ATCC3188株3、ATCC31884株(美國模式培養物集存庫(American Type Culture Collection)分售)，或AJ12740株(FERM P-12999)、AJ12741株(FERM P-13000)(日本專利特開1993-344881號公報)等苯丙胺酸生產性重組大腸桿菌等；作為其他苯丙胺酸生產性重組微生物，亦可列舉麩胺酸生產菌(Corynebacteirum glutamicum)等。
    又，酪胺酸生產菌較佳為使用公知技術以可大量生產L-酪胺酸(較佳為以D-葡萄糖作為基質而大量生產L-酪胺酸)之方式使基因變異之微生物。作為該酪胺酸生產性重組微生物，可列舉：利用公知之方法於苯丙胺酸生產菌(例如，大腸桿菌ATCC31882(自ATCC獲得))中導入tyrA基因(序列編號24：YP_002927556)而獲得之重組大腸桿菌；具有L-酪胺酸生產能力，且保持解除L-反饋抑制之變異型預苯酸脫氫酶之大腸桿菌屬微生物等(例如，參照日本專利特開2006-311833號公報及日本專利特開2007-325592號公報等)。
    本發明之轉形體(微生物)可藉由將以上述方式製作之基因表現用重組載體依據常規方法導入上述宿主中而獲得。
    作為該導入法，例如可列舉：電穿孔法、聚乙二醇法、土壤桿菌法、感受態法、乙酸鋰法及氯化鈣法等。只要根據使用之宿主細胞而適當選擇即可。
    最初，利用已知之苯丙酮酸還原酶生成之苯基乳酸的光學異構之知識極少。又，其中報告有生成之苯基乳酸為消旋體。根據此種狀況，可認為：工業上難以高濃度地獲得光學活性苯基乳酸，即難以獲得經高純度化之光學活性苯基乳酸。
    於此種狀況中，本發明之PPR可非常高純度地生成光學活性苯基乳酸，且對映體彼此間生理活性不同之可能性亦極低或幾乎不存在。並且，由於為不可逆之反應，故而亦可高濃度地蓄積光學活性苯基乳酸，因此就回收效率方面而言較為有利。進而，本發明之PPR對苯丙酮酸具有較高之親和性，並且除此以外可以4-羥基苯丙酮酸、乙醛酸、羥基丙酮酸等廣泛之物質作為基質。
    又，由於本發明之PPR之kcat/Km值高達已知之苯丙酮酸還原酶之kcat/Km值之數十倍，故而本發明之PPR亦可大量生成光學活性苯基乳酸。
    進而，本發明之PPR可利用使用對其進行編碼之基因之轉形體大量生產該酵素，故而亦可進而使用所獲得之PPR於工業上大量生產光學活性苯基乳酸。 <2. 光學活性3-苯基乳酸之製造方法>
    關於本發明之光學活性3-苯基乳酸之製造方法，只要至少具有可由苯丙酮酸生成D-3-苯基乳酸之製造步驟(酵素反應系統：參照上述流程1)即可。
    進而，具有由D-葡萄糖或L-苯丙胺酸等原料生成苯丙酮酸之製造步驟者由於製造成本或容易獲得，故而較佳。
    作為由D-葡萄糖生成苯丙酮酸之製造步驟，並無特別限定，可列舉有機合成法或醱酵法(生物合成反應)等，例如可列舉莽草酸路徑(Shikimate pathway)。
    又，作為由D-葡萄糖生成L-苯丙胺酸之製造步驟，並無特別限定，例如可列舉：日本專利特開平5-344811號公報或美國專利4681852號公報等公知之方法。又，由L-苯丙胺酸生成苯丙酮酸之製造步驟可列舉使用胺基轉移酶等轉胺酶之酵素反應系統。
    此時，較佳為使可由D-葡萄糖或L-苯丙胺酸等原料生成苯丙酮酸之製造步驟(例如利用酵素或微生物等之醱酵法之反應系統)包含於本發明之光學活性3-苯基乳酸製造法中。
    即，較佳為使用本發明之PPR及/或本發明之微生物，由基質生產光學活性3-苯基乳酸並將其回收。
    此時，只要使用至少含有本發明之PPR之酵素者即可，例如可使用培養本發明之微生物之培養液或其後去除微生物之培養液、去除微生物裂解液或裂解物之無細胞萃取液等。該等之中亦可含有用於莽草酸路徑之反應之一連串酵素群(具體而言，7-磷-2-脫氫-3-脫氧阿拉伯庚糖酸醛縮酶、3-脫氫奎尼酸合成酶、3-脫氫奎尼酸脫水酶、莽草酸脫氫酶、莽草酸激酶、3-磷莽草酸1-羧基乙烯基轉移酶(5-烯醇式丙酮醯莽草酸-3-磷酸合成酶)、分支酸合成酶、分支酸歧化酶等)、或苯丙胺酸合成系酵素群(具體而言，預苯酸脫氫酶、酪胺酸胺基轉移酶等)等。
    又，作為輔酶，較佳為使用NADPH及/或NADH，其中NADPH由於光學活性苯基乳酸之產率較高，故而較佳。
    本發明之光學活性3-苯基乳酸製造方法之反應形式並無特別限定，可以批次式進行，亦可以連續流通式進行。
    又，本發明之PPR或本發明之微生物亦可固定化。該固定化之方法只要為公知之方法則並無特別限定，例如可列舉：於水不溶性之載體上經由物理性吸附、離子鍵結、共價鍵而使微生物、酵素固定化之載體結合法；以戊二醛等具有二價官能基之試劑使其交聯固定化之交聯法；於具有網狀結構之凝膠或半透性膜中封入微生物、酵素之覆埋法等。
    又，反應所使用之溶劑可為極性或非極性溶劑之任意者，但較佳為水及/或水溶性溶劑，尤佳為90~100質量%之水。此處，所謂水溶性有機溶劑，較佳為容易使具有苯環之化合物溶解者，例如可列舉直鏈或支鏈等之醇類或酮等。作為該低級醇類(較佳為碳數1~5)，例如可列舉：甲醇、乙醇、丙醇等一元醇類，1,3-丁二醇等二元或多元醇類，亦可將該等適當組合。 (1)藉由本發明之酵素PPR製造光學活性苯基乳酸之方法
    可使用本發明之PPR由酵素基質生產光學活性3-苯基乳酸並將其回收。再者，亦可如上所述般藉由亦併用PPR以外之酵素而連續地獲得光學活性3-苯基乳酸。
    此處，作為酵素基質，係設為苯丙酮酸，由於光學活性苯基乳酸之產率較高，故而較佳。
    又，較佳為反應溫度較佳為設為5~50℃，更佳為設為10~40℃，進而較佳為設為20~40℃。
    又，較佳為反應時間(1循環)較佳為設為12小時~1週，更佳為設為2~4天。
    又，較佳為反應pH值較佳為設為5~8，更佳為設為6~7。此時之pH值調整可利用磷酸緩衝液等公知之pH值調整劑進行。 (2)藉由具有對本發明之PPR進行編碼之基因之微生物製造光學活性3-苯基乳酸之方法
    本發明之光學活性苯基乳酸之製造方法較佳為使用包含對含有如下(a)、(b)或(c)之蛋白質之苯丙酮酸還原酶進行編碼之基因的微生物進行培養，由微生物基質生成光學活性苯基乳酸並將其回收。
    (a)包含序列編號5所記載之胺基酸序列之蛋白質，(b)包含使序列編號5所記載之胺基酸序列置換、缺失、插入1個或多個胺基酸之胺基酸列，具有苯丙酮酸還原活性，且對於苯丙酮酸具有較高的親和性之蛋白質，(c)包含與序列編號5所示之胺基酸序列具有60%以上之同源性之胺基酸序列，具有苯丙酮酸還原活性，對於苯丙酮酸具有較高的親和性之蛋白質。
    此處，該微生物係指上述野生株(TK1菌株)及其變異株或上述轉形體等，可為好氧、厭氧之任一者。
    此時，作為微生物基質，較佳為選自D-葡萄糖、L-苯丙胺酸、苯丙酮酸等中之1種以上。
    又，於將微生物基質設為D-葡萄糖之情形時，可廉價地獲得，且可大量生產光學活性苯基乳酸，因此較佳，並且發現可由單純之糖之葡萄糖大量生產芳香族化合物且大量生產光學活性之3-D-苯基乳酸的ppr基因，其於產業上極為有益。於此種情形時，較佳為將對本發明之PPR進行編碼之基因導入L-苯丙胺酸生產性微生物中之重組微生物。
    再者，於利用微生物製造光學活性苯基乳酸之情形時，除如上所述含有對苯丙酮酸還原酶進行編碼之基因之微生物以外，為了生產上述微生物基質，亦可利用具有對用於莽草酸路徑反應之一連串酵素群進行編碼的基因之微生物、或具有對苯丙胺酸合成系酵素群進行編碼的基因之微生物等生產上述微生物基質之微生物。
    例如可列舉：使用生產上述微生物基質之微生物進行預培養後，使用本發明之微生物進行正式培養之方法；同時使用該等微生物進行培養之方法等。
    作為微生物培養中所使用之培養基，較佳為於各微生物之生長發育所使用之營養培養基中至少含有上述微生物基質者。此時，較佳為上述微生物基質於培養基中較佳為設為0.01~20%(質量/容量)，更佳為設為0.1~3%(質量/容量)，進而較佳為設為1~2%(質量/容量)。
    作為上述營養培養基，例如於微生物為酵母之情形時，可列舉如下之MM培養基：其係於培養基1 L中含有D-葡萄糖1~30 g、除葡萄糖以外之微生物基質0~5 g、NaNO3 5~7 g、KCl 0.4~0.6 g、MgSO4．7H2O 0.4~7 g、KH2PO4 1~2 g、漢氏微量元素(Hutner's Trace elements)1~3 mL、蒸餾水。關於漢氏微量元素，如下述實施例所述。又，亦可適當加入酵母萃取物0~3%、聚蛋白腖0~2%者。
    又，例如於微生物為大腸桿菌之情形時，可列舉如下之M9培養基：其係於培養基1 L中含有D-葡萄糖1~30 g、葡萄糖以外之微生物基質0~5 g、Na2PO4 5~7 g、KH2PO4 2~4 g、NaCl 9~11 g、NH4Cl 5~7 g、MgSO4．7H2O 0.4~7 g、CaCl2．H2O 0.02~0.04 g、鹽酸硫胺0.04~0.05 g、胰蛋白酶0.2~0.4 g、色胺酸0.2~0.4 g、漢氏微量元素1~3 mL、蒸餾水者。
    又，於為大腸桿菌之情形時，可列舉如下之苯基乳酸生產培養基：其係於培養基1 L中含有D-葡萄糖1~30 g、葡萄糖以外之微生物基質0~5 g、Na2HPO4 11~13 g、KH2PO4 5~7 g、NaCl 0.4~0.6 g、NH4Cl 0.9~1.1 g、MgSO4．7H2O 0.2~0.4 g、CaCl2．2H2O 0.01~0.02 g、鹽酸硫胺0.01~0.02 g、胰蛋白腖9~11 g、5.00 g/L之酵母萃取物4~6 g、微量元素21~3 mL、蒸餾水者。
    再者，關於漢氏微量元素及微量元素2，如下述實施例所述(參照表2及表12)。
    進而，較佳為添加胰蛋白酶9~11 g、酵母萃取物4~5 g。
    培養條件可根據使用之微生物而適當設定。
    培養溫度較佳為設為5~50℃、更佳為設為10~40℃、進而較佳為設為20~40℃時，微生物生長發育良好並且不使基質及生成物析出，因此較佳。
    又，較好為培養時間(1循環)較佳為設為0.5天~2週左右，更佳為設為1週左右，進而較佳為設為3~5天左右。
    又，較好為培養pH值較佳為設為4~9，更佳為，於為酵母之情形時設為6~7，於為大腸桿菌之情形時設為6~8。培養pH值之調整只要利用適當之pH值調整劑進行控制以使其於特定範圍內即可。
    又，較好為攪拌較佳為以100~1000 rpm、更佳以400~600 rpm進行。
    又，較好為於使用空氣進行透氣培養之情形時，較佳為設為0.01~1 L/min，更佳為設為0.1~0.3 L/min。
    進而，關於上述培養基質於培養期間內在培養基中之濃度，就生產效率方面而言較佳為以成為特定濃度內之方式進行調整，例如，亦可以較佳為0.1~5 g/L/h、更佳為1~2 g/L/h連續地或不連續地添加500 g/L之D-葡萄糖溶液。
    作為3-D-苯基乳酸之回收法，並無特別限定，可使用公知之分離純化方法。作為菌體之去除方法，可列舉離心分離或過濾等公知之方法。又，作為3-D-苯基乳酸之分離、純化方法，可列舉晶析、超濾、離子交換、活性碳處理、層析分離等公知之方法。
    作為層析分離，例如可列舉使用ODS管柱層析之方法等。又，作為晶析，可列舉有機溶劑之萃取及再結晶之方法等。作為較佳之一例，較佳為利用甲醇及己烷(=2：1~1：2)之混合溶劑：水=2：1~1：2之溶液進行萃取。 <3. 光學活性4-羥基苯基乳酸之製造方法>
    本發明之光學活性4-羥基苯基乳酸(D-4-羥基苯基乳酸)之製造方法只要至少具有可由4-羥基苯丙酮酸生成光學活性4-羥基苯基乳酸之製造步驟(酵素反應系統：參照上述流程2)即可。
    基質4-羥基苯丙酮酸係苯丙胺酸及酪胺酸之代謝中間體之一，故而只要進行利用該等之代謝系統之製造步驟即可。
    進而，具有由D-葡萄糖或L-酪胺酸等原料生成光學活性4-羥基苯基乳酸之製造步驟者就製造成本或容易獲得之方面而言較佳。
    作為由D-葡萄糖生成L-酪胺酸之製造步驟，並無特別限定，例如可列舉日本專利特開2006-311833號公報等公知之方法。又，關於由L-苯丙胺酸生成酪胺酸、繼而生成4-羥基苯丙酮酸之製造步驟，可列舉使用苯丙胺酸羥化酶或酪胺酸胺基轉移酶等之酵素反應系統。作為由D-葡萄糖生成4-羥基苯丙酮酸之製造步驟，並無特別限定，可列舉有機合成法或醱酵法(生物合成反應)等，例如可列舉莽草酸路徑(Shikimate pathway)。
    此時，較佳為使可由D-葡萄糖或L-酪胺酸等原料生成4-羥基苯丙酮酸之製造步驟(例如藉由酵素或微生物等之醱酵法之反應系統)包含於上述光學活性4-羥基苯基乳酸製造法中。
    即，較佳為使用上述生物觸媒(較佳為酵素及/或微生物)，由基質生產光學活性4-羥基苯基乳酸，其後回收光學活性4-羥基苯基乳酸(較佳為D-4-羥基苯基乳酸)。
    此時，可使用至少含有上述酵素者，例如可使用：培養上述微生物之培養液或其後去除微生物之培養液、去除微生物裂解液或裂解物之無細胞萃取液等。該等之中，亦可含有用於莽草酸路徑反應之一連串酵素群(具體而言，7-磷-2-脫氫-3-脫氧阿拉伯庚糖酸醛縮酶、3-脫氫奎尼酸合成酶、3-脫氫奎尼酸脫水酶、莽草酸脫氫酶、莽草酸激酶、3-磷莽草酸1-羧基乙烯基轉移酶(5-烯醇式丙酮醯莽草酸-3-磷酸合成酶)、分支酸合成酶、分支酸歧化酶等)、苯丙胺酸合成系酵素群(具體而言，預苯酸脫氫酶、酪胺酸胺基轉移酶等)、苯丙胺酸羥化酶等。
    又，作為輔酶，較佳為使用NADPH及/或NADH，其中NADPH由於光學活性4-羥基苯基乳酸之產率較高，故而較佳。
    本發明之光學活性4-羥基苯基乳酸製造法之反應形式並無特別限定，可以批次式進行，亦可以連續流通式進行。
    又，上述酵素或上述微生物亦可固定化。該固定化之方法只要為公知之方法則並無特別限定，例如可列舉：於水不溶性之載體上經由物理性吸附、離子鍵結、共價鍵而使微生物、酵素固定化之載體結合法；以戊二醛等具有二價官能基之試劑使其交聯固定化之交聯法；於具有網狀結構之凝膠或半透性膜中封入微生物、酵素之覆埋法等。
    又，反應所使用之溶劑可極性或非極性溶劑之任一者，但較佳為水及/或水溶性溶劑，尤佳為90~100質量%之水。此處，所謂水溶性有機溶劑，較佳為容易使具有苯環之化合物溶解者，例如可列舉直鏈或支鏈之醇類或酮。作為該低級醇類，例如可列舉：甲醇、乙醇、丙醇等一元醇類(較佳為碳數1~3)，1,3-丁二醇等二元或多元醇類，亦可將該等適當組合。 (1)藉由本發明之酵素PPR製造光學活性4-羥基苯基乳酸之方法
    可使用本發明之PPR，由酵素基質生產光學活性4-羥基苯基乳酸並將其回收。再者，亦可如上所述般藉由亦併用本發明之PPR以外之酵素而連續地獲得光學活性4-羥基苯基乳酸。
    此處，作為酵素基質，係設為4-羥基苯丙酮酸，由於光學活性4-羥基苯基乳酸之產率較高，故而較佳。
    又，較佳為反應溫度較佳為設為5~50℃，更佳為設為10~40℃，進而較佳為設為20~40℃。
    又，較佳為反應時間(1循環)較佳為設為12小時~1週，更佳為設為2~4天。
    又，較佳為反應pH值較佳為設為5~8，更佳為設為6~7。此時之pH值調整可利用磷酸緩衝液等公知之pH值調整劑而進行。 (2)藉由具有對本發明之PPR進行編碼之基因之微生物製造光學活性4-羥基苯基乳酸之方法
    本發明之光學活性4-羥基苯基乳酸之製造方法較佳為使用含有對本發明之PPR進行編碼之基因之微生物進行培養，由微生物基質生成光學活性4-羥基苯基乳酸並將其回收。
    此處，該微生物係指上述野生株及其變異株或上述轉形體等，可好氧、厭氧之任一者。例如可列舉：含有對4-羥基苯丙酮酸還原酶進行編碼之基因之菌株、含有對PPR酵素進行編碼之基因之菌株、及ATCC菌株等。
    此時，作為微生物基質，較佳為選自D-葡萄糖、L-酪胺酸、4-羥基苯丙酮酸中之1種以上。又，於使用本發明之酵素時，亦可組合其他酵素而生產光學活性4-羥基苯基乳酸。
    又，於將微生物基質設為D-葡萄糖之情形時，可廉價地獲得，且可大量生產光學活性4-羥基苯基乳酸，因此較佳，並且著眼於可由單純之葡萄糖選擇性地高純度地大量生產芳香族化合物、及D-4-羥基苯基乳酸的ppr基因並加以利用，於產業上極為有益。於此種情形時，較佳為經由載體等將對上述酵素進行編碼之基因導入L-酪胺酸生產菌之重組微生物。
    再者，於利用微生物製造光學活性4-羥基苯基乳酸之情形時，如上所述除含有對上述酵素進行編碼之基因之微生物以外，為了生產上述微生物基質，亦可利用如下可生產上述微生物基質的微生物：具有對用於莽草酸路徑反應之一連串酵素群進行編碼之基因的微生物，或具有對苯丙胺酸合成系之酵素群進行編碼之基因之微生物等。
    例如可列舉：使用生產上述微生物基質之微生物進行預培養後，使用本發明之微生物進行正式培養之方法；同時使用該等微生物進行培養之方法等。
    作為微生物培養所使用之培養基，較佳為於各微生物之生長發育所使用之營養培養基中至少含有上述微生物基質者。此時，較佳為於培養基中上述微生物基質較佳為設為0.01~20%(質量/容量)，更佳為設為0.1~3%(質量/容量)，進而較佳為設為1~2%(質量/容量)。
    關於上述營養培養基，例如於微生物為酵母之情形時，可列舉如下之MM培養基：其係於培養基1 L中含有D-葡萄糖1~30 g、葡萄糖以外之微生物基質0~5 g、NaNO3 5~7 g、KCl 0.4~0.6 g、MgSO4．7H2O 0.4~7 g、KH2PO4 1~2 g、漢氏微量元素1~3 mL、蒸餾水。關於漢氏微量元素，如下述實施例所述。又，亦可適當加入酵母萃取物0~3%、聚蛋白腖0~2%者。
    又，例如於微生物為大腸桿菌之情形時，可列舉如下之M9培養基：其係於培養基1 L中含有D-葡萄糖1~30 g、葡萄糖以外之微生物基質6~24 g、Na2HPO4 3~12 g、KH2PO4 0.5~1 g、NaCl 0.5~2 g、NH4Cl 0.05~0.05 g、MgSO4．7H2O 0.015~0.030 g、CaCl2．H2O 0.015~0.050 g、鹽酸硫胺0.050~0.10 g、色胺酸漢氏微量元素1~2 mL者。
    又，可列舉如下羥基苯基乳酸生產培養基(苯基乳酸生產培養基)：其係於培養基1 L中含有D-葡萄糖1~30 g、葡萄糖以外之微生物基質6~24 g、Na2HPO4 3~12 g、KH2PO4 0.5~1 g、NaCl 0.5~1.0 g、NH4Cl 0.05~1 g、MgSO4．7H2O 0.015~0.03 g、CaCl2．2H2O 0.015~0.05 g、鹽酸硫胺1~10 g、胰蛋白腖0~1.5 g、5.00 g/L之酵母萃取物0.5~5 g、微量元素2 1~3 mL、蒸餾水者。
    進而，較佳為添加胰蛋白腖5~20 g(較佳為9~11 g)、酵母萃取物4~7 g。
    培養條件可根據使用之微生物而適當設定。
    培養溫度較佳為設為5~50℃、更佳為設為10~40℃、進而較佳為設為20~40℃時，微生物生長發育良好並且未使基質及生成物析出，因此較佳。
    又，較佳為培養時間(1輪)較佳為設為0.5天~2週左右，更佳為設為1週左右，進而較佳為設為3~5天左右。
    又，較佳為培養pH值較佳為設為4~9，更佳為，於酵母之情形時設為6~7，於大腸桿菌之情形時設為6~8。培養pH值之調整可利用適當之pH值調整劑進行控制以使其於特定範圍內。
    又，較佳為攪拌較佳為以100~1000 rpm、更佳為以400~600 rpm進行。
    又，較佳為於使用空氣進行透氣培養之情形時，較佳為設為0.01~1 L/min，更佳為設為0.1~0.3 L/min。
    進而，就生產效率方面而言上述培養基質於培養期間內在培養基中之濃度較佳為以成為特定濃度內之方式進行調整，例如亦可以較佳為0.1~5 g/L/h、更佳為1~2 g/L/h連續地或不連續地添加500 g/L之D-葡萄糖溶液。
    又，pH值為6~8附近即可。
    作為利用上述製造方法所獲得之光學活性4-羥基苯基乳酸的回收法，並無特別限定，可使用公知之分離純化方法。作為菌體之去除方法，可列舉離心分離或過濾等公知之方法。又，作為光學活性4-羥基苯基乳酸(D-4-羥基苯基乳酸)之分離、純化方法，可列舉晶析、超濾、離子交換、活性碳處理、層析分離等公知之方法。
    作為層析分離，例如可列舉使用ODS管柱層析之方法等。
    又，作為晶析，可列舉有機溶劑之萃取及再結晶之方法等。作為一例，較佳為利用乙酸乙酯及己烷(=2：1~1：2)之混合溶劑：水=2：1~1：2之溶液進行萃取。此時，較佳為藉由利用鹽酸等酸使pH值成為2~4等而進行酸化。
    再者，若使用本發明之製造方法，則可獲得高純度之D-4-羥基苯基乳酸而並非消旋體，亦可簡化分離純化之步驟，因此本技術適於工業生產。並且，由於可容易地獲得對其適合之酵素及微生物，故而就該方面而言本技術亦適於工業生產。
    再者，作為高純度，任一者之比例均較高之情況較有利，較佳為85%以上、更佳為90%以上、進而較佳為95%以上、進而較佳為98%以上則較為有利。 實施例
    以下對具體實施例進行說明，但本發明並不限定於此。 <實施例1> D-3-苯基乳酸生產菌之篩選及其所生產之苯丙酮酸還原酶(PPR)之純化 (1)生產D-3-苯基乳酸之TK1菌株之獲取
    於數十處收取日本茨城縣築波市內環境中之土壤或水，適當稀釋後塗佈於YPD瓊脂培養基(2%之酵母萃取液、1%之聚蛋白腖、1%之D-葡萄糖/蒸餾水1 L)上。於28℃下培養2天至4天後，適當稀釋出現之菌落，其後接種於新YPD瓊脂培養基中，藉此進行純粹分離。進而將經分離之菌株1白金耳植菌於表1所示之基本培養基(Minimum medium，以下亦稱為「MM」)液體培養基中，於好氧條件下且在28℃下培養2天至4天。
    利用以下測定方法挑選光學活性苯基乳酸之產量良好者，並將其中之一作為TK1菌株。
    [3-苯基乳酸之定性及定量方法]
    1)使用氣相層析質量分析計(GC/MS，Gas Chromatography-Mass Spectrometry)之3-苯基乳酸之定性
    使試樣完全懸浮於1%之NaOH 200 μL、甲醇167 μL、吡啶34 μL中。於其中添加氯甲酸甲酯20 μL並劇烈攪拌，藉此使試樣甲基化。重複添加氯甲酸甲酯並攪拌之操作後，添加氯仿400 μL並進行攪拌。繼而，添加50 mM之碳酸氫鈉並去除攪拌後之水層。藉由於所獲得之氯仿層中添加0.1 g硫酸鈉而使氯仿層完全脫水，使用GC/MS(GCMS-QP2010 Plus、Shimadzu)對所獲得之溶液中所含之有機酸進行測定。以下，表示該GC/MS分析之條件。
    再者，於分析培養液之情形時，使用1%之NaOH將培養液5 mL之pH值自9調整至10，使用離心蒸發器進行減壓乾燥，而將其用作試樣。
    分析器：GC/MS-QP2010 Plus(Shimadzu)
    管柱：DB-5(0.32 mm×30 m)
    管柱溫度：60℃(2 min)-8℃/min-180℃(5 min)-40℃/min-220℃(5 min)
    界面溫度：230℃
    離子源溫度：250℃
    載氣：He
    流量：30 mL/min
    2)使用高速液體層析儀(HPLC)之3-苯基乳酸之定量
    試樣中之3-苯基乳酸之定量係使用HPLC並於以下之分析條件下進行。
    再者，於分析培養液之情形時，將藉由過濾或離心分離等而去除菌體之培養上清液用作試樣。
    分析器：HP-1100(Hewlett-Packard)
    管柱：TSKgel ODS-80(註冊商標)(4.6×150 mm、Tosoh、Tokyo、Japan)
    管柱溫度：28℃
    流速：1.0 mL/min
    流動相：20 mm磷酸鉀緩衝液(pH值2.5)：甲醇(6：4、v/v)
    3)使用HPLC之手性分析
    使用HPLC並於以下分析條件下決定試樣(酵素反應液)中之3-苯基乳酸的光學異構。再者，於分析培養液之情形時，將藉由過濾或離心分離等自培養液中去除菌體之培養上清液用作試樣。
    分析器：HP-1100(Hewlett-Packard)
    管柱：Nucleosil Chiral-1(Macherey-Nagel)
    管柱溫度：60℃
    流速：1.2 mL/min
    流動相：0.5 mM之CuSO4 (2)TK1菌株之鑑定
    自預先使菌體生長發育之YPD瓊脂培養基取出菌體1白金耳並植菌於分注於總容量50 mL之試管中之YPD培養基10 mL中，於30℃下以120 rpm振盪培養2天。
    自預培養液2.5 mL中藉由離心分離使菌體聚集，以生理食鹽水清洗其沈澱。將其植菌於10 mL之MM液體培養基之總容量50 mL之試管中，並於30℃下以120 rpm振盪培養2天。再者，於厭氧條件下培養時，以氮氣置換試管之氣體並塞入丁基橡膠栓，將其於30℃下以120 rpm振盪培養6天。 [26S rDNA-D1/D2鹼基序列解析]
    自萃取至循環測序為止之操作係依據DNA萃取(物理性破壞及Marmur(1961))、PCR(puReTaq Ready-To-Go PCR beads(Amersham Biosciences，NJ，USA))、循環測序BigDye Terminator v3.1試劑盒(Applied Biosystems，CA，USA)、使用引子(NL1及NL4(O'Donnell，1993))、序列(ABI PRISM 3130xl基因分析系統(Applied Biosystems，CA，USA))、相同性檢索及簡易分子系統解析(軟體Apollon2.0(TechnoSuruga Laboratory)、資料庫Apollon DB-FU3.0(TechnoSuruga Laboratory)、國際鹼基序列資料庫(GeneBank/DDBJ/EMBL))之各協定。 [生理性狀試驗]
    試驗方法係依據Barnett et al.(2000)及Kurtzman and Fell(1998)，培養係去除耐溫性試驗而於25℃下進行。進行表3所示之生理性狀之試驗。將其結果示於表3中。
    [簡易形態觀察]
    使用光學顯微鏡(BX Olympus、東京)進行簡易形態觀察。將其結果示於圖1中。再者，桿體(Bar)為5 μm。 [TK1菌株之鑑定]
    使用針對Apollon DB-FU之BLAST(Altschul,S.F.et al.,(1990)J.Mol.Biol.215：403-410.)之鹼基序列之相同性檢索的結果為：Strain TK1菌株之26S rDNA-D1/D2鹼基序列與作為子囊菌酵母之一種之螢光威克酵母之標準株NRRL YB-4819顯示100%之相同性。於針對GenBank/DDBJ/EMBL等國際鹼基序列資料庫之相同性檢索中，Strain TK1菌株之26S rDNA-D1/D2鹼基序列相對於螢光威克酵母之NRR YB-4819菌株亦顯示100%之較高之相同性。
    又，根據簡易形態觀察之結果確認：Strain TK1菌株之營養細胞為檸檬形、卵形、長卵形，增殖係藉由兩極出芽而出芽部位增寬並形成偽菌絲(圖1)。又，培養開始第19天時，可確認子囊中形成運動帽形之子囊胞子。該等之形態學觀察與螢光威克酵母之形態學特徵一致(Kurtzman C.P.,Fell J.W.The Yeasts：A Taxonomic Study,4th edition Elsevier,Amsterdam,Netherlands.)。
    生理、生物化學性狀試驗之結果為：Strain TK1菌株顯示糖醱酵性，作為碳源而不使肌醇同化，作為氮源而不使硝酸鹽同化(表3)。該等與威克酵母屬之特徵一致(Kurtzman C.P.,Fell J.W.The Yeasts：A Taxonomic Study,4th edition.Elsevier,Amsterdam,Netherlands.)。
    以上生理性狀試驗、簡易形態觀察之結果為支持26S rDNA-D1/D2鹼基序列之結果者。藉此，推測Strain TK1菌株屬於螢光威克酵母，並將本菌株命名為W.fluorescens TK1(螢光威克酵母TK1)。作為新穎之微生物，2010年12月13日於〒 305-8566茨城縣築波市東1-1-1築波中心中央第6、獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物寄存中心(IPOD)寄存為Wickerhamia fluorescens TK1(FERM AP-22048)。 (3)螢光威克酵母TK1菌株所生產之3-苯基乳酸之光學異構
    決定螢光威克酵母TK1菌株所生產之3-苯基乳酸之光學異構。將培養上清液供給至如上所述之手性分析(Nucleosil Chiral-1管柱)中(圖2)。其結果為，所生產之3-苯基乳酸顯示與D-3-苯基乳酸相同之保持時間，形成與L-3-苯基乳酸不同之波峰。藉此，明確螢光威克酵母TK1菌株對映選擇性地生產D-3-苯基乳酸(圖2)。
    再者，圖2(a)係D-3-苯基乳酸及L-3-苯基乳酸之樣品；(b)係本菌株之MM培養基培養後之上清液；(c)係本菌株之GPAMM培養基培養後之上清液；(d)係利用由本菌株所獲得之酵素處理苯丙酮酸之基質者。 (4)使用MM培養基(最少培養基)以螢光威克酵母TK1菌株進行培養時之D-3-苯基乳酸的生產性
    使初始菌體濃度成為0.2(O.D.600)並使用MM培養基於好氧條件下將螢光威克酵母TK1菌株振盪培養(三角瓶(Baffled Flask)、100 mL)5天，對培養上清液進行經時取樣。其結果為，菌體之增殖於培養開始24小時以後進入定常期。D-3-苯基乳酸之產量即便進入定常期亦繼續增長，培養開始第96小時於培養基中生產0.1 mM之D-3-苯基乳酸(圖3)。
    再者，圖3~5之「細胞密度」(Cell Density)表示菌體量，「PLA」表示D-3-苯基乳酸之濃度，且「PPA」表示苯丙酮酸之濃度，「Phe」表示L-苯丙胺酸。 (5)苯丙胺酸及苯丙酮酸對於D-3-苯基乳酸之生產之影響
    使初始菌體濃度成為0.2(O.D.600)，分別使用於MM培養基中添加有苯丙酮酸之GPAMM培養基(表4)、及於MM培養基中添加有L-苯丙胺酸之GPMM培養基(表5)於好氧條件下將螢光威克酵母TK1菌株分別振盪培養(三角瓶、100 mL)2天及3天，並對培養液進行經時取樣，測定本菌之D-3-苯基乳酸之產量(圖4及5)。

    其結果為，若於培養基中添加L-苯丙胺酸，則與不添加時相比，螢光威克酵母TK1菌株之菌體量為5.1倍，生產D-3-苯基乳酸57.5倍。又，若添加苯丙酮酸，則菌體量為1.5倍，生產D-3-苯基乳酸8.9倍。
    於培養基中添加5 mM之L-苯丙胺酸之情形時，於培養24小時後檢測不出L-苯丙胺酸，反而蓄積有同級別(5.7 mM)之D-3-苯基乳酸。藉此，可認為藉由本菌使L-苯丙胺酸轉變為D-3-苯基乳酸。即，可認為本菌株具有生成光學活性苯基乳酸之酵素。
    又，可見伴隨L-苯丙胺酸之減少及D-3-苯基乳酸之生產的菌體之增殖。若對使用添加有L-苯丙胺酸之GPMM培養基(圖4)之培養、使用未添加L-苯丙胺酸之MM培養基之培養(圖3)、使用添加有苯丙酮酸之GPAMM培養基(圖4)的培養中之菌體之增殖量進行比較，則使用添加有L-苯丙胺酸之GPMM培養基之培養中最多。
    可認為其原因在於：由於將自L-苯丙胺酸之胺基游離之氨用作氮源，故而促進本菌之增殖。 (6)含有螢光威克酵母TK1菌株所生產之酵素之無細胞萃取液的製備
    每1.0 g重量之濕菌體添加氧化鋁2.5 g、以及蛋白酶抑制劑苯甲基磺醯氟(PMSF)、N-甲苯磺醯基-L-苯丙氨醯甲基氯酮(TPCK)各0.2 mM、含有10%之甘油及1 mM之二硫蘇糖醇(DTT)的20 mM磷酸緩衝液，使用杵及研缽將菌體研碎。於裂解液中添加與菌體等量之相同之緩衝液，以15000×g進行離心分離。將所獲得之培養上清液作為無細胞萃取液。以上操作係於冰中進行。 (7)自無細胞萃取液中回收本酵素PPR之條件的研究
    於將作為觸發苯丙酮酸向D-3-苯基乳酸之還原之酵素(苯丙酮酸還原酶)的本酵素PPR自螢光威克酵母TK1菌株之無細胞萃取液中純化之前，對本菌之正式培養之培養時間及無細胞萃取液中之PPR活性的關係進行研究。使用GPMM培養基由培養開始4、12、48小時後之菌體製備無細胞萃取液，結果培養時間12小時之PPR活性與4小時、48小時相比分別高1.8、3.4倍(圖6)。
    根據以上結果，純化所使用之菌體係使用培養12小時者。再者，培養開始12小時後與進行3-苯基乳酸之生產之時間一致，故而暗示本有酵素PPR與3-苯基乳酸之生產相關之可能性。 (8)本酵素PPR之最適pH值之研究
    將pH值5.5~8之三羥甲基胺基甲烷-氯化氫緩衝液(pH值7、7.5、8)、磷酸緩衝液(pH值5.5、6、6.5、7)之各pH值緩衝液用於反應液中而測定PPR活性，研究本酵素PPR之反應之最適pH值。於pH值6.5下檢測出最高PPR活性(圖7)。因此，本酵素PPR之最適pH值為6.5，以後之活性測定之pH值6.5。 (9)來自螢光威克酵母TK1菌株之本酵素PPR之製備
    如上所述製備無細胞萃取液，並以100,000×g將該無細胞萃取液離心分離1小時。
    進而，如下所示般，利用丁基瓊脂糖凝膠(丁基瓊脂糖凝膠)管柱、2'5'-ADP-瓊脂糖凝膠(2'5'-ADP-Sepharose)管柱、繼而MonoQ HR 5/5管柱之各種層析法進行分離純化，由離心分離後之無細胞萃取液獲得本酵素PPR。 [丁基瓊脂糖凝膠管柱]
    於離心分離後之無細胞萃取液中以成為20%之方式添加硫酸銨。將沖洗緩衝液(10%之甘油、1 mM之二硫蘇糖醇(DTT，dithiothreitol)、20 mM之磷酸緩衝液、20%之(NH4)2SO4，pH值7)以管柱容積之5倍量進行沖洗而進行管柱之平衡化。於該管柱中放置製備之樣本並根據硫酸銨之直線濃度斜率(20%-0%)進行溶出，而獲得活性餾分。 [2'5'-ADP-瓊脂糖凝膠管柱]
    使以上述方式獲得之活性餾分相對於透析緩衝液(10%之甘油、1 mM之DTT、20 mM之磷酸緩衝液，pH值7)進行一晚之透析。將該樣本供給至沖洗5倍量之沖洗緩衝液(10%之甘油、1 mM之DTT、20 mM之磷酸緩衝液，pH值7)而平衡化之2'5'-ADP-瓊脂糖凝膠管柱。溶出係利用溶離緩衝液(10%之甘油、1 mM之DTT、0.1-1 mM之NADP+、20 mM之磷酸緩衝液，pH值7)而進行，獲得活性餾分。 [MonoQ HR 5/5管柱]
    將以上述方式獲得之活性餾分供給至經平衡緩衝液(10%之甘油、1 mM之DTT、20 mM之磷酸緩衝液，pH值7)平衡化之MonoQ HR 5/5管柱(GE Healthcare)，並根據NaCl直線濃度斜率(0%-15%)而進行溶出。 [PPR活性之測定法]
    PPR之活性測定係藉由使用50 mM之磷酸緩衝液(pH值6.5)、2 mM之苯丙酮酸、0.1 mM之NADPH作為酵素反應液，並於其中添加試樣(酵素液或無細胞萃取液等)而開始反應。反應溫度為25℃。活性係藉由如下方式定量：利用紫外可見分光計(Beckman-Coulter DU-800)對伴隨於反應而生成之NADPH所具有之對340 nm波長之吸收的減少進行測定。NADPH對340 nm之波長之吸收的莫耳吸光係數為6.2 mM-1．cm-1。 [苯丙胺酸轉胺酶(PAT)之活性測定]
    PAT之活性測定係藉由使用50 mM之磷酸緩衝液(pH值6.5)、10 mM之L-苯丙胺酸、2.5 mM之2-氧基戊二酸、12.5 μm磷酸吡哆醛作為酵素反應液，並於其中添加試樣(酵素液或無細胞萃取液等)而開始反應。反應溫度係設為37℃，反應時間係設為30分鐘。藉由添加2N之NaOH 800 μL而終止反應。活性係以如下方式定量：對伴隨於反應而生成之苯丙酮酸所具有之對320 nm波長之吸收的增加進行測定。再者，苯丙酮酸之莫耳吸光係數係設為17.5 mM-1．cm-1(Whitaker RJ.,et al.J.Biol.Chem.(1982)257,3550-3556.)。 [PPR之分子量之定量]
    PPR之分子量之測定係藉由使用12.5%之聚丙烯醯胺凝膠之SDS-PAGE及/或凝膠過濾法而進行。
    於使用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳法時，係依據Laemmli等人之方法而進行。
    又，於使用凝膠過濾法時，將使用聚乙二醇20,000而濃縮之純化本酵素PPR樣本等供給至預先經溶離緩衝液(10%之甘油、1 mM之DTT、20 mM之磷酸緩衝液、0.15 mM之NaCl，pH值7)平衡化之Superose 6 10/300，並以管柱容量之1倍之溶離緩衝液進行溶出。
    作為標準蛋白質，使用牛血清白蛋白(M.W.67,000)、胰凝乳蛋白酶原(M.W.25,000)、α-澱粉酶(M.W.45,000)、β-澱粉酶(M.W.200,000)。
    由菌體30 g所製備之無細胞萃取液中之蛋白質總量為592.2 mg，D-3-苯基乳酸之生產之總活性為190.8 μmol/mL。即，可確認苯丙酮酸還原酶存在於無細胞萃取液中。
    將對其進行離心分離而獲得之可溶性餾分如上所述般依序供給至丁基瓊脂糖凝膠(疏水管柱)、2'5'-ADP-瓊脂糖凝膠(親和管柱)、Mono Q HR 5/5(強陰離子交換管柱)中，結果可將本酵素PPR之比活性濃縮至2260倍，且可以產率41%對本酵素PPR進行純化(表6)。
    將純化之本酵素PPR供給至SDS-PAGE，結果顯示為單一基因帶，且其分子量為40,000(圖8)。已明確，根據凝膠過濾法估算經純化之本酵素PPR酵素之分子量為80,000，藉此本酵素PPR形成同型二聚體(圖8)。
    (10)由螢光威克酵母TK1菌株所生成之酵素之各性質 [PPR之酵素學解析]
    可藉由上述HPLC之測定方法而確認，本酵素PPR以依存於NADPH之方式與苯丙酮酸進行反應而生成D-3-苯基乳酸。
    又，可確認由2 mM之苯丙酮酸與2 mM之NADPH生產2 mM之3-苯基乳酸，故而表示該反應中以下之化學計量成立(流程1)。
    將D-3-苯基乳酸、L-3-苯基乳酸、NAD+、NADP+之組合用作基質時，不進行酵素反應，因此表示利用本酵素PPR之反應為不可逆反應。
    又，本酵素PPR係將NADPH用作輔酶而還原苯丙酮酸、4-羥基苯丙酮酸、乙醯酸及羥基丙酮酸(流程1及流程2)。
    此時，kcat/Km值為以苯丙酮酸作為基質時之最大值，為373 s-1mM-1(表7)。
    又，以NADH作為輔酶時之kcat/Km值為330 s-1mM-1，為以NADPH作為輔酶時(10143 s-1mM-1)之1/31之較低值。因此表示，本酵素可利用NADH及NADPH作為輔酶，對於NADPH之特異性較高。
    [金屬離子及抑制劑之影響]
    將各金屬離子及各抑制劑分別以最終濃度1 mM添加於反應系統中，測定PPR活性。發現由於Cu2+、Zn2+、Fe2+、WO2-、Hg2+金屬離子而使本酵素PPR活性下降(表8)，因此表示該等抑制PPR活性。
    [D-3-苯基乳酸生產菌及其生產之PPR之各性質]
    檢索D-3-苯基乳酸生產菌，結果子囊菌酵母螢光威克酵母TK1菌株於培養上清液中生產D-3-苯基乳酸0.1 mM，故而可認為可篩選新穎之D-3-苯基乳酸生產菌。又，將L-苯丙胺酸添加於培養基中並同樣地進行培養時，D-3-苯基乳酸之產量為5.7 mM。報告有：3-苯基乳酸之生產之報告中的白地絲黴菌係藉由使用TSBYE培養基並使用缸式醱酵槽進行培養而生產3.6~6.0 mM之3-苯基乳酸(非專利文獻2)；乳酸菌係藉由使用MRS培養基而生產0.57 mM之3-苯基乳酸(J.Biochem.2005 138,741-74915)。又，乳酸桿菌SK007(Lactobacillus.Sp.SK007)於將作為3-苯基乳酸之前驅物之苯丙酮酸6 mM添加於培養基中時，生產5.2 mM之3-苯基乳酸(Li,X.et al.,Biotechnol.Lett(2007)29,593-597)，胚芽乳酸桿菌TMW1.468(L.plantarum TMW1.468)、舊金山乳酸桿菌(L.sanfranciscensis DSM20451)於將50 mM之苯丙胺酸添加培養基中之情形時生產0.04~0.08 mM之3-苯基乳酸(Vermeulen,N.et al.J.Agric.Food Chem.(2006)54,3832-3839)。以上結果顯示：螢光威克酵母TK1菌株使用缸式醱酵槽等且不精密控制培養條件而具有相對較高之生產D-3-苯基乳酸之能力。
    又，螢光威克酵母TK1菌株對映選擇性地生產D-3-苯基乳酸。化工產品、醫藥品有時如撒利多胺所代表般對映體彼此間之生理活性不同。因此，謀求對映選擇性地製造手性分子。因此可認為，本菌具有較高之對映選擇性並生產D-3-苯基乳酸之情況就考慮將本化合物用於醫藥品原料等之方面而言具有重大意義。
    又，關於純化之本菌之PPR活性，以苯丙酮酸作為基質時之kcat/Km值為373 s-1mM-1。該值係與迄今為止所報告之任一戊糖乳酸桿菌JCM1558(Lactobacillus pentosus JCM1558)(非專利文獻15)、Lactobacillu.plantarum ATCC 8041之DLDH(Taguchi,H.；Ohta,T.J.Biol.Chem.(1991)266,12588-12594)、豆根瘤菌CFN 42(Rhizobium etli CFN 42)之GRHPR(Fauvart,M.et al.Biochimica et Biophysica Acta 1774(2007)1092-1098)之分子活性相比更高之者(表9)。
    又，至今為止唯一以來自經純化之真菌之苯丙酮酸作為基質的酵素、即麥牙糖念珠菌L4(Candida maltosa L4)之D-4-羥基苯基乳酸脫氫酶係與螢光威克酵母TK1菌株之PPR同樣地對於苯丙酮酸及4-羥基苯丙酮酸顯示較高之親和性。然而，D-4-羥基苯基乳酸脫氫酶必需以Mn2+作為補因子，且分子量為250,000-280,000，與本菌PPR之分子量相比非常大。又，本酵素PPR對於苯丙酮酸之親和性最高，相對於此，D-4-羥基苯基乳酸脫氫酶對於4-羥基苯丙酮酸之親和性較高，因此亦可認為二者為不同酵素。
    非專利文獻15
    Taguchi,H.；Ohta,T.J.Biol.Chem.(1991)266,12588-12594
    Fauvart,M.et al.Biochimica et Biophysica Acta 1774(2007)1092-1098 <實施例2> ppr基因之選殖及於大腸桿菌中之表現 (1)使用菌株
    使用3-苯基乳酸生產菌螢光威克酵母TK1菌株。
    將大腸桿菌Origami B(DE3)用作PPR表現用宿主。於質體之成型時，使用大腸桿菌JM109株。 (2)培養方法
    自預先使菌體生長發育之YPD瓊脂培養基取出菌體1白金耳並植菌於分注總容量50 mL之試管中之上述YPD培養基10 mL中，於30℃下以120 rpm振盪培養2天。藉由離心分離使菌體自預培養液中集菌，以生理食鹽水清洗其沈澱。將其植菌於含有150 mL之GPMM培養基之總容量500 mL之三角瓶中。將其於30℃下以120 rpm且於好氧條件下振盪培養12小時。 (3)本酵素PPR之N末端胺基酸序列解析 [墨點]
    將2張濾紙分別浸於A溶液(0.3 M三羥甲基胺基甲烷-氯化氫、5%甲醇)中，1張浸於B溶液(25 mM三羥甲基胺基甲烷-氯化氫、5%甲醇)中，浸於C溶液(25 mM三羥甲基胺基甲烷-氯化氫、40 mM之6-胺基己酸、5%甲醇)中3張。將純化之本酵素PPR以SDS-PAGE進行電泳後，使凝膠與各浸於溶液中之濾紙重疊，再使用轉錄裝置(Horizeblot AE-6670P/N、ATTO)電性地轉錄於聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(AE-6665、ATTO)上。 [蛋白質序列]
    自經乾燥之PVDF膜切出目標之基因帶，並供給至胺基酸序列分析裝置(Applied Biosystems Procise 492 cLC)。 (4)本酵素PPR之內部胺基酸序列之決定
    將於SDS-PAGE中泳動過之純化本酵素PPR藉由凝膠切斷，並藉由胰蛋白酶進行凝膠內消化。將胰蛋白酶消化肽供給至介質輔助雷射脫附/離子化飛行時間質譜儀(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of Flight/Mass Spectrometry，MALDI-TOF/MS)(AXIMA(註冊商標)、AXIMA(註冊商標)-QIT Shimazu)，並基於所獲得之片段資訊決定胺基酸序列。 (5)cDNA之製備
    使於GPMM培養基中培養之螢光威克酵母TK1菌株懸浮於裂解緩衝液(500 mM之NaCl、200 mM三羥甲基胺基甲烷-氯化氫(pH值7.5)、10 mM之EDTA、1% SDS)中，添加一半量之玻璃珠及等量之苯酚-氯仿-異戊醇(25：24：1)(苯氯處理)。以漩渦攪拌器攪拌後進行離心分離，回收上清液，進行脫氧核糖核酸酶(DNase，Deoxyribonuclease)處理，並重複2次苯酚-氯仿-異戊醇萃取，再添加2.5倍量之乙醇及1/10倍量之3M乙酸鈉(乙醇沈澱)。離心分離後，使沈澱懸浮於RLC(附屬於RNeasy(註冊商標)Plant Mini Kit(RNeasy植物小量提取試劑盒)者)450 μL、2-巰基乙醇4.5 μL中。以後之步驟中依據RNeasy(註冊商標)Plant Mini Kit之協定。使用經調整之RNA及PrimeScript(註冊商標)Reverse Transcriptase(PrimeScript逆轉錄酶)合成cDNA。 (6)全DNA之製備
    使於YPD培養基中培養一夜之螢光威克酵母TK1菌株懸浮於裂解緩衝液(100 mM之NaCl、10 mM三羥甲基胺基甲烷-氯化氫(pH值8.0)、1 mM之EDTA、2% TritonX-100)中，並添加一半量之玻璃珠及等量之苯酚-氯仿-異戊醇(25：24：1)(苯氯處理)。以漩渦攪拌器攪拌後進行離心分離，回收上清液，重複2次苯酚-氯仿-異戊醇萃取，再添加2.5倍量之乙醇及1/10倍量之3 M乙酸鈉(乙醇沈澱)。離心分離後將沈澱以70%乙醇清洗。丟棄70%乙醇以抽氣器使其乾燥，使其懸浮於添加有核糖核酸酶(RNase，Ribonuclease)之適量滅菌水中。 (7)選殖 [PCR法]
    於50 μL之PCR反應系統中，添加所獲得之cDNA 1 μL作為範本、10×KOD-Plus緩衝液(TOYOBO)5 μL、2.5 mM之dNTP 4 μL、2.5 mM之引子NP(5'-ATGAARAARCCNCAGGT-3')(序列編號10)1 μL、2.5 mM之Oligo dT(5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3')(序列編號11)1 μL、2.5 mM之KOD-Plus-DNA聚合酶(TOYOBO)1 μL、25 mM之MgSO4 2 μL。對該反應系統進行35次96℃下30 s、50℃下30 s、68℃下3 min之處理後，使其於68℃下延伸反應5 min(一次PCR)。進而，添加PCR產物作為模板1 μL、10×Ex Taq緩衝液(TaKaRa)5 μL、2.5 mM之dNTP 4 μL、2.5 mM之引子NP(序列編號10)、2.5 mM引子2427P(5'-GGYTCYTCYTCRAANACRTT-3')(序列編號12)、2.5 mM之Ex Taq聚合酶(TaKaRa)0.5 μL。進行35次96℃下15 s、56℃下20 s、72℃下1 min之處理，使其於72℃下延伸反應5 min(二次PCR)。 [PPR基因之全長解析]
    以製備之全RNA為基礎，使用cDNA末端快速擴增技術(Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE)5' RACE系統第2.0版(Invitrogen Co.,CA)合成PPR之5'-末端之cDNA。以所獲得之cDNA作為模板，使用試劑盒附帶之接合器寡核苷酸及對編碼PPR之基因特異之引子(GSP1(5'-TGAAAATGCGTTAGTATGTGGAT-3')(序列編號13)、GSP2(5'-TGCCTTTGCTGCTTTGAATGTAT-3')(序列編號14))形成nested PCR。關於PCR之反應條件，進行35次96℃下15 s、56℃下20 s、72℃下1 min之處理，使其於72℃下延伸反應5 min。藉由瓊脂糖電泳而回收以PCR所獲得之200 kp之DNA片段，並選殖於pGEM(註冊商標)-T easy(Promega，Madison，WI)中。決定所獲得之質體之插入片段的DNA序列。
    3'-末端係以藉由cDNA末端快速擴增技術3' RACE系統(Invitrogen Co.,CA)所合成之cDNA為模板，使用引子GSP(5'-AACTACGAGGTGCTGCC-3')(序列編號15)、引子GSP nest(5'-GTCCTCCCCAGTTACCATATATAGC-3')(序列編號16)以與上述相同之方式進行PCR，而決定所獲得之270 kb之片段的鹼基序列。 [DNA序列解析]
    DNA之序列解析係使用全自動DNA定序儀(CEQ2000，Beckman Coulter)進行解析。方法係依據協定而進行。 (8)即時PCR
    將螢光威克酵母TK1菌株使用MM培養基、GPMM培養基、GPAMM培養基於30℃下培養8小時，由所獲得之各培養基之菌體製備RNA。將其作為範本，並使用Oligo-dT19引子、逆轉錄酶M-MLV(TAKARA BIO，Inc.，Japan)進行逆轉錄反應。以所獲得之單鏈cDNA作為範本，使用iQ(註冊商標)SYBR(註冊商標)Green Supermix(Bio-Rad Laboratories Inc.,CA)供給至MiniOpticon(註冊商標)第3.1版(Bio-Rad Laboratories Inc.,CA)。將各菌體中pprA基因之表現量表示為其與18S核糖體核糖核酸(ribosomal RNA)之表現量之比。
    表現之比率(pprA/18SrDNA)=2CT(pprA)-CT(18S ribosom)
    ＊CT係增幅產物蓄積而獲得之可檢測出之螢光訊號之週期數。
    再者，使用之酵素pprA(pprART F(5'-ATTTAGCCGCGATGAAAGAAC-3')(序列編號17)、pprART R(5'-TCGGCAAAGGCACATCC-3')(序列編號18))及18S ribosome之引子(18SRT F(5'-ACCAGGTCCAGACACAATAAGG-3')(序列編號19)、18SRT R(5'-AAGCAGACAAATCACTCCACC-3')(序列編號20))係使用引子製作軟體primer3(http：//frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3.cgi)而設計。 (9)使用大腸桿菌之重組PPR(rPPR)之表現、純化 [轉形體之製作]
    使用由螢光威克酵母TK1菌株之RNA製備之單鏈cDNA及引子Nde-PPR(5'-GGGTTTCATATGAAAAAGCCTCAG-3')(序列編號21)、Xho-PPR(5'-CCGCTCGAGAACTACAAGATT-3')(序列編號22)，藉由PCR反應而增幅pprA基因之cDNA片段。將使以NdeI、XhoI對其進行處理者與預先以相同限制酵素對pCWori進行處理者連結而成型的質體(pCW-PPR)導入至大腸桿菌ATCC31882(由ATCC獲取)中(參照圖9及圖10)。 [表現之誘導]
    將所獲得之重組體於含有最終濃度100 μg/L之安比西林鈉之LB培養基(LA)10 mL中於37℃下培養12小時。將其總量植菌於150 mL LA中。以120 rpm於37℃下培養2小時後，添加最終濃度1 mM之IPTG，並以50 rpm於室溫下培養8小時。 [rPPR之純化]
    收集培養之菌體，使其懸浮於緩衝液A(20 mM磷酸鉀(pH值7.0)、10%甘油、0.1 mM之DTT)中，並進行超音波裂解。將裂解液以15,000 rpm離心分離30分鐘並回收上清液(無細胞萃取液)。預先使其吸附Ni2+後，將無細胞萃取液供給至經含有300 mM之NaCl之緩衝液A(緩衝液C)平衡化之螯合瓊脂糖凝膠管柱(Amersham)中。回收以含有500 mM咪唑之緩衝液C溶出之餾分，並對緩衝液A進行透析，用於後續之解析中。 (10)分子系統解析 [胺基酸序列之比對]
    於美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)之資料庫內，檢索到選殖之pprA基因之與推測胺基酸序列具有相同性的序列。此時使用BLAST。利用所獲得之序列資訊進行ClustalW之多重比對解析。 [系統樹之製作]
    系統樹之製作係使用MEGA 4。系統樹之製作所使用之胺基酸序列係由NCBI而獲得。系統樹之製作係藉由鄰接法而進行，於分枝上顯示自舉反覆推測值。 (11)本酵素PPR之N末端胺基酸序列之決定
    將純化之本酵素PPR(1 μg)於PVDF膜上電性地描畫墨點，分析本酵素PPR之N末端之胺基酸序列。其結果為，可決定包含本酵素PPR之12個殘基MKKPOVLILGRI之N末端胺基酸序列(序列編號1)。 (12)本酵素PPR之內部胺基酸序列之獲取
    將SDS-PAGE後之本酵素PPR自凝膠中切出，並使用胰蛋白酶進行凝膠內消化。對所獲得之胰蛋白酶消化肽進行MALDI-TOF MS解析。自藉由MALDI-TOF MS解析所獲得之肽波峰中，選擇m/z 2000.00及m/z 2427.27兩種肽，進行使用MALDI-QIT-TOF MS之MS/MS解析(圖11)。以所獲得之質量片段波峰之資訊為基礎進行胰蛋白酶消化肽之胺基酸序列之重生測序(de nivo sequence)，結果顯示m/z 2000.00之肽可獲得包含19個胺基酸殘基NIQAIYGNWGGLASFGGFK之胺基酸序列(序列編號2)，顯示m/z 2427.27之肽可獲得包含22個胺基酸殘基VAFAALDVFEEEPFIHPGLIGR之胺基酸序列(序列編號3)(圖12)。 (13)pprA基因之選殖
    基於N末端胺基酸序列(序列編號1)及內部胺基酸序列m/z 2427.27(序列編號3)之資訊，分別設計引子NP(序列編號10)、引子2427P(序列編號12)。以由螢光威克酵母TK1菌株製備之cDNA作為範本，使用引子NP(序列編號10)、引子Oligo dT(序列編號11)進行PCR。進而，以PCR產物作為範本，使用引子NP(序列編號10)、引子2427P(序列編號12)進行PCR。其結果為，935 bp之目標之DNA片段增幅(圖13)。
    以經增幅之DNA之鹼基序列為基礎設計引子，藉由RACE法解析pprA基因之兩末端之鹼基序列。其結果顯示，pprA基因包含對364個殘基之胺基酸進行編碼之1,095 bp之鹼基對(圖14：序列編號4及5)。於該推測胺基酸序列中，可同時發現上述所決定之PPR之N末端及內部胺基酸序列。又，若對由基因組DNA增幅之序列及由cDNA增幅之序列進行比較，結果明確pprA基因中不存在內含子。 (14)pprA基因於染色體上之副本數
    為了確認存在於螢光威克酵母TK1菌株之基因組上之pprA基因的副本數而進行南方墨點解析(圖15)。對於經限制酵素(HindIII、EcoRI、PstI、BamHI)處理之螢光威克酵母TK1菌株之全DNA，以含有pprA基因之序列之DNA片段作為探針進行南方雜交。其結果為，於使用任一經限制酵素處理之全DNA之情形時，基因帶均只檢測出一條。藉此表示，存在於基因組上之pprA基因僅有1個副本，純化之本酵素PPR係發現有pprA基因者。 (15)L-苯丙胺酸之本酵素PPR之表現控制
    分別使用GPMM培養基(含有D-葡萄糖及L-苯丙胺酸)、GPAMM培養基(含有D-葡萄糖及苯丙酮酸)、MM培養基(含有D-葡萄糖)將螢光威克酵母TK1菌株於30℃下分別培養10小時，並將所獲得之菌體之無細胞萃取液中之PPR活性依據上述[PPR活性之測定法]進行測定。其結果為，使用添加有L-苯丙胺酸之GPMM培養基所獲得之菌體之無細胞萃取液中的PPR活性為0.22 μmol/min/mg，與使用MM培養基進行培養時的活性相比為3.6倍。又，與使用添加有苯丙酮酸之GPAMM培養基時相比高3.0倍(圖16)。將於相同條件下將螢光威克酵母TK1菌株培養8小時所獲得之菌體之pprA基因的轉錄量使用即時PCR進行測定。其結果為，使用添加有5 mM苯丙胺酸之GPMM培養基進行培養之菌體中的pprA基因之表現量與使用MM培養基之條件相比增加40倍，與使用GPAMM培養基進行培養之條件相比增加18倍(圖16)。根據以上結果顯示，pprA基因之表現受苯丙胺酸誘導。 (16)使用大腸桿菌之酵素rPPR之表現、純化 [酵素rPPR之純化]
    於大腸桿菌Origami B株中導入在pET21a中組入pprA基因之cDNA的質體。使於N末端加成His之本酵素PPR表現後，使用螯合瓊脂糖凝膠管柱進行純化(圖17)。其結果顯示，由於40 kDa中獲得單一基因帶，故而可使酵素rPPR純化。 [酵素rPPR之酵素學各性質]
    純化之酵素rPPR係與螢光威克酵母TK1菌株之酵素PPR相同，可將NADPH用作輔酶，且以苯丙酮酸、4-羥基苯丙酮酸、乙醛酸及羥基丙酮酸作為基質時之kcat/Km值中，以苯丙酮酸作為基質時最高(表10)。又，未檢測出以丙酮酸及草醯乙酸作為基質之活性(資料未顯示)。藉此顯示，使用大腸桿菌所表現之酵素rPPR亦與來自螢光威克酵母TK1菌株之酵素PPR顯示相同之基質特異性。
    (17)本酵素PPR之分子系統解析 [酵素PPR之比對解析]
    酵素PPR之推測胺基酸序列與相同性最高之都柏林念珠菌(Candida dubliniensis)之功能未知基因之推測胺基酸序列僅顯示54%之相同性。又，於功能明確之蛋白質之胺基酸序列中與來自L.plantarum之D-乳酸脫氫酶(DLDH)僅顯示20%之相同性，與R.etli CFN 42之重組GRHPR僅顯示25%相同性，與來自變葉草(Solenostemon scutellarioide)之羥基苯丙酮酸還原酶(HPPR)僅顯示27%之相同性。
    使用C.dubliniensis之功能未知基因、來自L.plantarum之DLDH、R.etli CFN 42之重組GRHPR、來自S.scutellarioide之HPPR及螢光威克酵母TK1菌株之推測胺基酸序列進行比對解析。
    於螢光威克酵母TK1菌株之推測胺基酸序列上之第185-331個上發現NADH/NADPH結合區域。進而被認為NADH/NADPH結合結構之序列-G-X-G-X-X-G-於發現於PPR之推測胺基酸序列中(圖18)。又，鑑定為來自人之GRHPR(Booth MP,et al.J Mol Biol.(2006)360,178-189.)之基質結合部位的基質之羧基之氧原子與氫結合之第86個纈胺酸(V)(V83 in GRHPR)、第87個之甘胺酸(G)(GRHPR：G274)、基質之羧基與羰基之氧原子與氫結合之第282個精胺酸(R)(GRHPR：R269)殘基保存於酵素PPR中。亦保存有作為酸鹼基觸媒之第329個組胺酸(H)(GRHPR：H329)殘基及H329殘基之咪唑環與氧結合之第311個麩胺酸(E)(GRHPR：E311)殘基。由於DLDH及GRHPR係屬於D-異構體特異性2-羥基酸脫氫酶超家族之酵素，故而暗示本供試菌之PPR亦屬於相同家族。 [系統樹]
    挑選屬於GRHPR、HPPR、DLDH、甲酸脫氫酶(Formate Dehydrogenase，FDH)、L-乳酸脫氫酶(L-lactate dehydrogenase，LLDH)及蘋果酸脫氫酶(Malatedehydrogenase，MDH)家族之已知的酵素，及與本酵素PPR相同性較高之功能未知蛋白質之胺基酸序列，並製作分子系統樹。其結果為，PPR係屬於與LLDH、MDH超家族不同之簇，分類為D-異構體特異性2-羥基酸脫氫酶超家族。
    為進行進而詳細之系統解析，選擇屬於D-異構體特異性2-羥基酸脫氫酶超家族之HPPR或屬於GRHPR家族之酵素，及本酵素PPR以及與本酵素PPR顯示相同性之功能未知蛋白質之胺基酸序列，製作系統樹。其結果為，本菌之PPR不屬於現存之HPPR或GRHPR家族，與子囊菌酵母之功能未知蛋白質形成新簇。藉此明確：PPR形成屬於D-異構體特異性2-羥基酸脫氫酶超家族之新穎家族。其家族於系統樹上位於HPPR及GRHPR家族附近，該情況顯示，本酵素PPR與HPPR或GRHPR家族之酵素相同，與以苯丙酮酸、4-羥基苯丙酮酸、乙醛酸及羥基丙酮酸作為基質而辨認方面相關。 [本酵素PPR之功能性]
    於本研究中，新發現可生產D-3-苯基乳酸及光學活性4-羥基苯基乳酸之子囊菌酵母螢光威克酵母TK1菌株。進而將與由供試菌生產D-3-苯基乳酸及D-4-羥基苯基乳酸相關之本酵素PPR純化，選殖作為其基因之pprA基因。至今為止並無將與生產D-3-苯基乳酸及D-4-羥基苯基乳酸直接相關之酵素純化而選殖其基因的報告，本研究為最初之例。又顯示，本酵素PPR係與報告為與3-苯基乳酸之生產有關之乳酸菌的DLDH於酵素學解析、分子系統解析之任一結果上均不同之酵素。藉由系統解析，本酵素PPR無法分類為D-異構體特異性2-羥基酸脫氫酶超家族之現存家族中，而劃分為與子囊菌酵母之功能未知蛋白質相同之群中。藉此暗示如下可能性：本酵素PPR係屬於D-異構體特異性2-羥基酸脫氫酶超家族之新穎酵素，其功能保存於子囊菌酵母中。
    將由本研究所明確之螢光威克酵母TK1菌株中生產D-3-苯基乳酸之機構的模型示於圖19中。可認為，於以葡萄糖為碳源之情形時，由莽草酸路徑所供給之苯丙酮酸藉由本酵素PPR而還原並生成D-3-苯基乳酸。又，於將苯丙胺酸添加於培養基中之情形時，苯丙胺酸藉由胺基轉移酶而使胺基脫落並轉換成苯丙酮酸。進而，藉由本酵素PPR並由苯丙酮酸以NADPH為輔酶而還原性地生產D-3-苯基乳酸。又，pprA基因於苯丙胺酸之存在下在轉錄級別上之表現量增大。實際上，於蛋白質級別PPR活性亦增加3.6倍，關於D-3-苯基乳酸之產量，添加苯丙胺酸時與未添加時相比亦增加58倍。
    關於乳酸菌中之3-苯基乳酸之生產可認為：觸發自丙酮酸向乳酸之轉換之LDH亦對苯丙胺酸之代謝中間體苯丙酮酸顯示觸媒作用，因此而副帶生產(Valerio F.et al.,(2004)FEMS Microbiol Letters,233,289-295)。然而，本供試菌之本酵素PPR並不顯示LDH活性，識別作為基質之2-酮酸中對於苯丙酮酸之親和性最高。該情況顯示，本酵素PPR之功能與通常之乳酸菌之LDH不同。
    又明確，本酵素PPR係使由4-羥基苯丙酮酸生成D-4-羥基苯基乳酸。
    藉此可知，本供試菌中，3-苯基乳酸及D-4-羥基苯基乳酸之生產並非副產性，而為藉由本酵素PPR之特異性生產。
    本研究中，藉由利用大腸桿菌之pET系統而於重組PPR之表現及純化中獲得成功
    又，根據本研究，於與芳香族化合物之生物合成相關之新穎的酵素PPR之純化、其基因之選殖及於異種生物中成型表現系統方面獲得成功。可認為，該成果會發揮用於今後之芳香族系化合物之醱酵生產的作用。3-苯基乳酸係顯示廣泛抗菌活性之抗菌物質，與此同時亦期待其可作為芳香族系聚合物之素材(Tsuji H.et al.,J.Appl.Polymer Sci.,110,3954-3962(2008))。芳香族系聚合物中包括酚醛樹脂所代表之苯酚樹脂或聚苯醚，通常具有耐熱性、耐化學品性等優異物性。
    然而，其原料之供給只要來自石油，於被稱為循環型社會之現在，要求轉變為來自生質之原料。至今為止，作為生物聚合物而研究其實用化者之主流為聚乳酸。聚乳酸係使原料乳酸藉由交酯聚合或直接聚合而獲得(Yin,M.；Baker,G.L.Macromolecules 1999,32,7711.)。發展聚乳酸之實用化之理由在於：原料乳酸為代謝之基本產物，乳酸菌之乳酸醱酵等生物基中之生產的研究正興盛地進行。或許，若確立芳香族系代謝產物之醱酵生產技術，則可認為可穩定地供給原料而可製造來自生質之芳香族系聚合物。根據本研究可認為，藉由明確D-3-苯基乳酸之生產機構，而完成至今為止研究較為困難之使用D-3-苯基乳酸之生物聚合物之功能解析的超越。 <實施例3> D-3-苯基乳酸生產系統之成型 (1)導入有ppr基因之苯丙胺酸生產性大腸桿菌的製備
    將D-3-苯基乳酸之生產株於LB培養基{10.0 g/L之胰化蛋白、5.0 g/L之酵母萃取液、10.0 g/L之NaCl}中培養一晚後，以總量之20%添加滅菌甘油，並於-80℃下保存。
    預培養係於試管中裝入5.0 mL LB培養基，對於培養基接種1/100量之甘油保存溶液，並於37℃下以120 rpm振盪培養約6小時。
    首先，於苯丙胺酸生產性之ATCC31882株(由ATCC獲得)中，依據上述方法製作質體，並使用其將ppr基因導入，製備轉形之新穎苯基乳酸生產株。 (2)新穎苯基乳酸生產株之培養
    將本苯基乳酸生產株使用於50 mL苯基乳酸生產培養基(表11及12)中添加有20 g/L之葡萄糖及50 mg/L之康黴素者，接種1/100量之上述預培養液，並於500 mL容積之三角瓶中於37℃下以120 rpm振盪培養24小時。

    將其結果示於圖20及表13中。再者，D-3-苯基乳酸及L-苯丙胺酸之定量係使用RP-18管柱(MERCK公司製造)，以HPLC(HEWLETT PACKARD公司製造SERIES1100)進行。
    關於苯基乳酸之光學活性，使培養基中之苯基乳酸藉由再結晶法而純化，將其樣本供給至如上所述之NUCLEOSIL Chiral-1管柱(MACHEREY-NAGEL公司製造)而決定。
    D-葡萄糖之定量係使用葡萄糖CII測試試劑盒(Wako公司製造)而進行。
    藉由將pprA基因分別導入苯丙胺酸生產株ATCC31882株，而於製作分別生產99%以上D-3-苯基乳酸之有用株(ATCC31882/pHSGpprA)上獲得成功。
    繼而以實用化為目標，使用ATCC31882 pHSGpprA株，進行缸式醱酵槽之D-3-苯基乳酸生產(圖21)。
    將400 mL上述苯基乳酸生產培養基裝入1.0 L容積之缸式醱酵槽，並接種1/100量之預培養液，於37℃下，以500 rpm，並以0.2 L/min(0.5 vvm)之空氣進行透氣，進而使用5N NaOH將pH值控制於7.0，培養96小時。為了培養環境之穩定化，添加有適量消泡劑。
    再者，關於碳源D-葡萄糖，使用蠕動泵，將500 g/L之D-葡萄糖溶液以成為1.50 g/L/h之速度添加於培養基中。
    又，關於營養所需成分L-酪胺酸及L-色胺酸，為防止長期培養之欠乏，預先於苯基乳酸生產培養基中分別添加0.50 g/L。
    最終，培養96小時時可生產D-3-苯基乳酸15.5 g/L(相對糖產率10.8%)。再者，相對糖產率係利用D-3-苯基乳酸之生成量(g)/D-葡萄糖之總添加量(g)而算出。
    (4)生產之D-3-苯基乳酸之純化
    培養基中生產之D-苯基乳酸係採用使用有機溶劑之萃取法及再結晶法而純化。萃取溶劑係使用甲醇與己烷之混合溶劑(混合比1：1)。
    首先，於離心分離而去除菌體之培養上清液中添加鹽酸使其酸化，於其中添加等量萃取溶劑，緩慢攪拌30分鐘，進行萃取操作。
    其後，回收有機溶劑層，於培養液中再次添加新萃取溶劑，進行上述步驟。進行2次該等步驟，並將回收之有機溶劑層藉由蒸發而蒸乾，獲得含有D-3-苯基乳酸之粉末固體。
    為由所獲得之粉末固體獲得高純度之D-3-苯基乳酸，可添加甲苯，並於90~100℃下使粉末充分溶解，其後緩慢使其冷卻，藉此於甲苯溶液中獲得白色結晶。
    去除甲苯，將經清洗之白色結晶供給至手性管柱及GC/MS(GC-2010 SHIMADZU公司製造)，結果確認，白色結晶為高純度之D體3-苯基乳酸。
    以上，確立了如下技術：藉由使用本發明之PPR，進行光學活性D-3-苯基乳酸之醱酵生產，並高純度地獲得產物D-3-苯基乳酸。又，其產量與已報道者相比亦非常多，可用於下面之產業用途中。 <實施例4> 利用對PPR進行編碼之基因之光學活性4-羥基苯基乳酸生產系統的成型 (1)導入有ppr基因之L-酪胺酸生產性大腸桿菌的製備
    將光學活性4-羥基苯基乳酸之生產株於LB培養基{10.0 g/L之胰化蛋白、5.0 g/L之酵母萃取液、10.0 g/L之NaCl}中培養一晚後，以總量之20%添加滅菌甘油，並於-80℃下保存。
    預培養係於試管中裝入5.0 mL LB培養基，對於培養基接種1/100量之甘油保存溶液，並於37℃下以120 rpm振盪培養約6小時。
    首先，於苯丙胺酸生產性之ATCC31882株(由ATCC獲得)中，依據上述方法製作質體pTyrA(圖22)，使用其將tyrA基因(序列編號23)導入而獲得L-酪胺酸生產菌，該tyrA基因係藉由使序列編號24所示之鹼基序列第779個鹼基之C變為T而使第260個Thr經取代為Ile。於該L-酪胺酸生產菌中，依據上述方法製作質體(pCWpprA或pHSGpprA)，使用其進而將ppr基因導入，製備轉形之新穎光學活性羥基苯基乳酸生產株(NST-pprA生產株)。 (2)具有PPR之新穎光學活性羥基苯基乳酸生產株之培養
    使用於50 mL D-羥基苯基乳酸生產培養基(表14及表15)中添加偶20 g/L之葡萄糖及50 mg/L之康黴素者，並接種1/100量之上述預培養液，於500 mL容積三角瓶中，於37℃下以120 rpm振盪將具有PPR之光學活性羥基苯基乳酸生產株培養24小時。
    於使用以葡萄糖為碳源之培養基對所獲得之轉形體進行培養時，於培養基中檢測出4-羥基苯基乳酸。所生產之4-羥基苯基乳酸係D-4-羥基苯基乳酸。目前為止，2.5 g/L之D-4-羥基苯基乳酸之醱酵生產(相對糖產率8%)成為可能(表16)。

    (3)含有對PPR進行編碼之基因之微生物所生產之光學活性4-羥基苯基乳酸的純化
    培養基中所生產之D-4-羥基苯基乳酸係採用使用有機溶劑之萃取法及再結晶法而純化。萃取溶劑係使用乙酸乙酯與己烷之混合溶劑(混合比1：1)。
    首先，於進行離心分離而去除菌體之培養上清液中添加鹽酸使其酸化(pH值2.5~3.5)，於其中添加等量萃取溶劑，緩慢攪拌30分鐘，進行萃取操作。
    其後，回收有機溶劑層，於培養液中再次添加新萃取溶劑，進行上述步驟。藉由蒸發而將回收之有機溶劑層蒸乾，獲得含有D-4-羥基苯基乳酸之粉末固體。
    為了由所獲得之粉末固體獲得高純度之D-4-羥基苯基乳酸，可添加甲苯并於90~100℃下使粉末充分溶解，其後使其緩慢冷卻，藉此於甲苯溶液中獲得白色結晶。
    將去除甲苯并經清洗之白色結晶供給至手性管柱及GC/MS(GC-2010 SHIMADZU公司製造)，結果確認，白色結晶為高純度之光學活性D-4-羥基苯基乳酸(純度約99%)(參照圖23)。 <實施例5> 利用酵母W.fluoresensTK1株之D-4-羥基苯基乳酸之醱酵生產
    顯示，本菌可使添加於培養基中之酪胺酸轉換成4-羥基苯基乳酸。可認為，本菌係以葡萄糖為原料，經由莽草酸路徑、4-羥基苯丙酮酸而生成4-羥基苯基乳酸。所生產之4-羥基苯基乳酸係光學活性體(D-4-羥基苯基乳酸)。 <使用高速液體層析法(HPLC)之4-羥基苯基乳酸的定量>
    試樣中之羥基苯基乳酸之定量係使用HPLC並於以下分析條件下進行。
    再者，於分析培養液之情形時，將藉由過濾或離心分離等而去除菌體之培養上清液用作試樣。
    分析器：HP-1100(Hewlett-Packard)
    管柱：TSKgel ODS-80(註冊商標)(4.6×150 mm,Tosoh,Tokyo,Japan)
    管柱溫度：28℃
    流速：0.8 mL/min
    流動相：20 mm磷酸鉀緩衝液(pH值2.5)：甲醇(6：4，v/v) <使用氣相層析質量分析計(GC/MS)之4-羥基苯基乳酸之定性>
    使用1%之NaOH將培養液5 mL之pH值自9調整至10，並使用離心蒸發器進行減壓乾燥。使所獲得之沈澱完全懸浮於1%之NaOH 200 μL、甲醇167 μL、吡啶34 μL中。於其中添加氯甲酸甲酯20 μL，並藉由劇烈攪拌而使試樣甲基化。反覆進行添加氯甲酸甲酯並攪拌之操作後，添加氯仿400 μL並進行攪拌。繼而，添加50 mM碳酸氫鈉，並去除攪拌後之水層。藉由於所獲得之氯仿層中添加0.1 g硫酸鈉而使氯仿層完全脫水，使用GC/MS(GCMS-QP2010 Plus、Shimadzu)對所獲得之溶液中所含之有機酸進行測定。分析條件如下所示。
    分析器：GC/MS-QP2010 Plus(Shimadzu)
    管柱：DB-5(0.32 mm×30 m)
    管柱溫度：60℃(2 min)-8℃/min-180℃(5 min)-40℃/min-220℃(5 min)
    界面溫度：230℃
    離子源溫度：250℃
    載氣：He
    流量：30 ml/min <生產之4-羥基苯基乳酸之光學異構> [使用HPLC之手性分析]
    使用HPLC並於以下之分析條件下決定培養液中之4-羥基苯基乳酸之光學異構。再者，將藉由過濾或離心分離等而自培養液中去除菌體之培養上清液用作試樣。
    分析器：HP-1100(Hewlett-Packard)
    管柱：Nucleosil Chiral-1(Macherey-Nagel)
    管柱溫度：60℃
    流速：1.2 mL/min
    流動相：0.5 mM之CuSO4 <生產之4-羥基苯基乳酸之光學異構>
    將回收培養上清液並以適當甲醇進行稀釋而成者作為分析試樣。羥基苯基乳酸濃度之測定係使用HPLC並於以下之分析條件下決定。
    分析器：HP-1100(Hewlett-Packard)
    管柱：ODS-column(5C18-MS-II：COSMSIL)
    管柱溫度：28℃
    流速：0.8 mL/min
    流動相：20 mM磷酸：甲醇=4：6
    以上，若利用本發明之酵素PPR，則可使酪胺酸轉換成D-4-羥基苯基乳酸。進而，藉由利用經由莽草酸路徑及羥基苯丙酮酸之轉形體，可以葡萄糖作為原料而生成D-4-羥基苯基乳酸。
    並且，若利用本發明之酵素PPR及對其進行編碼之基因，則亦可選擇性地製作D-4-羥基苯基乳酸。
    因此，確立如下技術：進行D-苯基乳酸及D-4-羥基苯基乳酸之醱酵生產，並高純度地獲得作為產物之D-苯基乳酸及D-4-羥基苯基乳酸。又，其產量與已報告者相比亦非常多，對於下一項之產業上之可利用性較為有益。 產業上之可利用性
    由單獨發現之新穎之D-3-苯基乳酸生產菌，獲得可高效地獲得高純度之光學活性3-苯基乳酸及4-羥基苯基乳酸的本發明之PPR及對其進行編碼之pprA基因。藉由導入有pprA基因之轉形體，可以廉價之葡萄糖作為原料而高效地獲得高純度之光學活性3-苯基乳酸及4-羥基苯基乳酸，亦可於基因工程上進行製造。
    該光學活性3-苯基乳酸於廣泛之領域中受到注目，例如期待其用作聚芳香族系塑膠原料、生物適合性材料、功能性材料、醫藥農業中間體。同樣地，亦期待光學活性4-羥基苯基乳酸用作食品添加物、醫藥、農藥等。進而，有可能實現先前認為較為困難之用於芳香族系化合物之醱酵生產技術成型的超越。
    圖1係螢光威克酵母TK1菌株之光學顯微鏡像。
    圖2「L-苯基乳酸與D-苯基乳酸之HPLC分佈」之(a)係D-3-苯基乳酸及L-3-苯基乳酸之樣品/L-苯基乳酸於22.4分鐘時形成最初之波峰而溶出，D-苯基乳酸於31.7分鐘時溶出；(b)係螢光威克酵母TK1於MM培養基中培養後之上清液；(c)係螢光威克酵母TK1於GPAMM培養基中培養後之上清液；(d)係利用由本菌株所獲得之酵素處理苯丙酮酸基質者。
    圖3係表示螢光威克酵母TK1菌株於培養中之菌體量及光學活性苯基乳酸之生產量。
    圖4係表示螢光威克酵母TK1菌株於培養中之菌體量、光學活性苯基乳酸(PLA)之生產量、苯丙酮酸(PPA)之生產量者。
    圖5係表示螢光威克酵母TK1菌株於培養中之菌體量、光學活性苯基乳酸(PLA)之生產量、L-苯丙胺酸(Phe)之生產量者。
    圖6係表示螢光威克酵母TK1菌株每隔一定培養時間(2、12、48小時)之苯丙酮酸還原酵素活性者。
    圖7係表示螢光威克酵母TK1菌株於各pH值[Tris-HCl緩衝液(pH值7、pH值7.5、pH值8)、磷酸緩衝液(pH值5.5、pH值6、pH值6.5、pH值7)]下之將pH值6.5之PPR活性設為100時的各PPR活性(相對比)者。
    圖8「PPR之分子量」之(a)係表示本酵素PPR之SDS-PAGE電泳分析(右側)；(b)係表示本酵素PPR之凝膠過濾分析(黑色菱形)。
    圖9係含有本發明之ppr基因(pprA基因)之質體載體之製作的例示。
    圖10係含有本發明之ppr基因(pprA基因)之轉形體的例示。
    圖11「對於1個來自PPR之胰蛋白酶肽之MALDI-TOF的MS圖譜及MALDI-QIT-TOF之MS2圖譜/來自螢光威克酵母NRRLYB-4819之PPR之陽離子MALDI-TOF質譜」係表示本發明之內部胺基酸序列之MALDI-TOF之MS圖譜。
    圖12「對於1個來自PPR之胰蛋白酶肽的MALDI-TOF之MS圖譜及MALDI-QIT-TOF之MS2圖譜/面板所示之m/z 2000.0(a)及2427.3(b)中之質譜離子波峰的MS/MS圖譜」係表示本發明之內部胺基酸序列之MALDI-TOF之MS圖譜。(a)係序列編號2所示之胺基酸序列；(b)係序列編號3所示之胺基酸序列。
    圖13「巢式PRC(nested PCR)產物之瓊脂糖凝膠電泳」係表示以N末端胺基酸序列(序列編號1)及內部胺基酸序列(序列編號3)之資訊為基礎而獲得之935 bp之DNA片段之瓊脂糖凝膠電泳。1：pprA之PCR產物，M：DNA標記物。
    圖14「螢光威克酵母TK1 ppr基因之核苷酸序列及其推測胺基酸序列」係表示來自螢光威克酵母(W.fluorescens)TK1菌株之ppr基因及其胺基酸序列。將由MALDI-QIT-TOF MS分析所決定之PPR之內部胺基酸序列以框表示。將引子NP及Oligo dT之位置以箭頭表示。將巢式引子2427P(nested primer 2427P)以虛線箭頭表示。將終止密碼子以星號表示。
    圖15「將pprA用作探針之全DNA之南方墨點分析」表示對於以限制酵素(HindIII、EcoRI、PstI、BamHI)處理之螢光威克酵母TK1菌株之全DNA，以含有pprA基因之序列之DNA片段作為探針之南方雜交。將螢光威克酵母TKI菌株之全DNA以限制酵素HindIII、EcoRI、PstI、BamHI進行消化、電泳，並於Zeta-Probe(註冊商標)墨點膜片(Bio-Rad)上描畫墨點，再使用探針進行雜交。
    圖16「苯丙胺酸於PPR活性及基因表現中之效果」係表示將螢光威克酵母TK1菌株以GPMM培養基(+Phe)、GPAMM培養基(+PPA)、MM培養基(Glc)進行培養時之PPR活性及ppr基因(pprA基因)表現量。(A)係於30℃下培養10小時之螢光威克酵母TK1之無細胞萃取液中之PPR的比活性。於含有56 mM葡萄糖(Glc)、56 mM葡萄糖+5 mM苯丙胺酸(+Phe)或56 mM葡萄糖+5 mM苯丙酮酸(+PPA)之MM培養基中培養細胞。(B)係pprA轉錄物之定量之PCR。將螢光威克酵母NRRLYB-4819如上述般進行培養。條形圖係由即時PCR所決定之相對表現比率。
    圖17「純化rPPR(recombinant PPR，重組PPR)之SDS-PAGE」表示含有ppr基因之大腸桿菌生產之酵素rPPR之SDS-PAGE的結果。Lane 1：純化rPPR，M：分子量標準(Bio-Rad精確蛋白質標準試劑盒)。將分子量示於左端。
    圖18「來自螢光威克酵母TK1之PPR與來自其他微生物之PPR的推測胺基酸序列之多重比對」表示使用來自螢光威克酵母TK1菌株之酵素PPR及來自其他微生物之酵素(DLDH、GRHPR、HPPR)之胺基酸序列的比對解析結果。使用CLUSTALX進行蛋白質之一級結構之比對。序列係C.dubliniensis(Accession No.：XP_002418129)、E.coli(P37666)、S.scutellarioide(Q65CJ7)及L.plantarum(BAA14352)之PPR相關蛋白質。星號表示同一胺基酸。點及冒號表示羥取代之保留性胺基酸。破折號表示電腦生成之空隙。框架內表示NAD結合結構之保留性序列。
    圖19係表示螢光威克酵母TK1菌株中之D-3-苯基乳酸之生物合成系統。
    圖20表示含有ppr基因之苯丙胺酸生產性微生物產生之苯基乳酸。
    圖21表示含有pprA基因之苯丙胺酸生產性微生物(ATCC31882株/pHSGpprA)以D-葡萄糖作為基質時之菌體濃度及苯基乳酸生產量。
    圖22表示含有tyrA基因之表現載體。
    圖23係4-羥基苯基乳酸之HPLC分析。標準；D,L-4-羥基苯基乳酸(左側：L-4-羥基苯基乳酸/右側：D-4-羥基苯基乳酸)；NST-ldhA菌株之L-4-羥基苯基乳酸；NST-pprA菌株生成之D-4-羥基苯基乳酸。
    <110> 日商旭化成化學股份有限公司
    <120> 苯丙酮酸還原酵素與使用本酵素之光學活性苯基乳酸及4-羥基-苯基乳酸之製造方法
    <130> F111236-WO
    <140> 101103183
    <141> 2012-01-31
    <150> 2011-018892
    <151> 2011-01-31
    <150> 2011-018895
    <151> 2011-01-31
    <160> 24
    <170> PatentIn第3.5版
    <210> 1
    <211> 11
    <212> PRT
    <213> 螢光威克酵母
    <400> 1
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    <212> PRT
    <213> 螢光威克酵母
    <400> 2
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    <212> PRT
    <213> 螢光威克酵母
    <400> 3

    <210> 4
    <211> 364
    <212> PRT
    <213> 螢光威克酵母
    <400> 4


    <210> 5
    <211> 1095
    <212> DNA
    <213> 螢光威克酵母
    <220>
    <221> CDS
    <222> (1)..(1095)
    <400> 5



    <210> 6
    <211> 20
    <212> DNA
    <213> 螢光威克酵母
    <220>
    <223> 保留性-1
    <400> 6
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    <211> 20
    <212> DNA
    <213> 螢光威克酵母
    <220>
    <223> 保留性-2
    <400> 7
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    <212> DNA
    <213> 螢光威克酵母
    <220>
    <223> 特異性-1
    <400> 8
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    <211> 584
    <212> DNA
    <213> 螢光威克酵母(W.fluorescens)TK1(FERM P-22048)
    <220>
    <223> rDNA-D1/D2
    <400> 9

    <210> 10
    <211> 17
    <212> DNA
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 引子NP
    <220>
    <221> misc_feature
    <222> (12)..(12)
    <223> n為a,c,g，或t
    <400> 10
    <210> 11
    <211> 20
    <212> DNA
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> T重複寡核苷酸
    <400> 11
    <210> 12
    <211> 20
    <212> DNA
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 引子2427P
    <220>
    <221> misc_feature
    <222> (15)..(15)
    <223> n為a,c,g，或t
    <400> 12
    <210> 13
    <211> 23
    <212> DNA
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 引子GSP1
    <400> 13
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    <211> 23
    <212> DNA
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 引子GSP2
    <400> 14
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    <211> 17
    <212> DNA
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 引子GSP
    <400> 15
    <210> 16
    <211> 25
    <212> DNA
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 引子GSP巢
    <400> 16
    <210> 17
    <211> 20
    <212> DNA
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> pprART F
    <400> 17
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    <211> 17
    <212> DNA
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> pprART R
    <400> 18
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    <212> DNA
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 引子18SRT F
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    <212> DNA
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 引子18SRT R
    <400> 20
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    <211> 24
    <212> DNA
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 引子Nde-PPR
    <400> 21
    <210> 22
    <211> 21
    <212> DNA
    <213> 引子Xho-PPR
    <400> 22
    <210> 23
    <211> 1122
    <212> DNA
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 來自大腸桿菌BW2952之tryA基因
    <220>
    <221> CDS
    <222> (1)..(1122)
    <400> 23



    <210> 24
    <211> 1122
    <212> DNA
    <213> 來自大腸桿菌BW2952之tryA基因
    <220>
    <221> CDS
    <222> (1)..(1122)
    <400> 24


    权利要求:
    Claims (12)
    [1] 一種多核苷酸，其係對以苯丙酮酸作為基質而生成D-苯基乳酸之苯丙酮酸還原酵素進行編碼者，且選自由如下多核苷酸所組成之群中：(a)包含序列編號5所示之鹼基序列之多核苷酸；(b)與包含序列編號5所示之鹼基序列之多核苷酸於嚴格條件下雜交之多核苷酸；(c)含有與包含序列編號5所示之鹼基序列之多核苷酸具有60%以上之同源性之鹼基序列的多核苷酸；(d)含有序列編號6、7或8所示之鹼基序列之多核苷酸；(e)對序列編號4所示之胺基酸序列進行編碼之多核苷酸；(f)對使序列編號4所示之胺基酸序列缺失、置換或加成1個或多個胺基酸之胺基酸序列進行編碼的多核苷酸；及(g)對與序列編號4所示之胺基酸序列具有60%以上之同源性之胺基酸序列進行編碼的多核苷酸。
    [2] 一種苯丙酮酸還原酵素，其係以苯丙酮酸作為基質而生成D-苯基乳酸者，且含有如下之任一者：(a)序列編號4所示之胺基酸序列；(b)使序列編號4所示之胺基酸序列缺失、置換或加成1個或多個胺基酸之胺基酸序列；或(c)與序列編號4所示之胺基酸序列具有60%以上之同源性之胺基酸序列。
    [3] 一種重組載體，其含有如請求項1之多核苷酸。
    [4] 一種轉形體，其含有如請求項3之重組載體。
    [5] 如請求項4之轉形體，其宿主為微生物。
    [6] 如請求項5之轉形體，其中上述微生物為大腸桿菌、或者苯丙胺酸或酪胺酸生產性重組微生物。
    [7] 一種D-苯基乳酸或D-4-羥基苯基乳酸之製造方法，其特徵在於：使用包含如下(a)、(b)或(c)之蛋白質之苯丙酮酸還原酵素，以苯丙酮酸或4-羥基苯丙酮酸作為基質而生成D-苯基乳酸或D-4-羥基苯基乳酸，並將其回收：(a)包含序列編號4所示之胺基酸序列之蛋白質；(b)包含使序列編號4所示之胺基酸序列缺失、置換或加成1個或多個胺基酸之胺基酸序列之蛋白質；或(c)包含與序列編號4所示之胺基酸序列具有60%以上之同源性之胺基酸序列之蛋白質。
    [8] 如請求項7之D-苯基乳酸或D-4-羥基苯基乳酸之製造方法，其中上述苯丙酮酸還原酵素之反應條件為反應溫度20~40℃、pH值6~7。
    [9] 一種D-苯基乳酸或D-4-羥基苯基乳酸之製造方法，其特徵在於：使用含有對包含如下(a)、(b)或(c)之蛋白質之苯丙酮酸還原酵素進行編碼之基因的微生物加以培養，由微生物基質生成D-苯基乳酸或D-4-羥基苯基乳酸，並將其回收：(a)包含序列編號4所示之胺基酸序列之蛋白質；(b)包含使序列編號4所示之胺基酸序列缺失、置換或加成1個或多個胺基酸之胺基酸序列的蛋白質；或(c)包含與序列編號4所示之胺基酸序列具有60%以上之同源性之胺基酸序列的蛋白質。
    [10] 如請求項9之D-苯基乳酸或D-4-羥基苯基乳酸之製造方法，其中上述微生物為威克酵母屬酵母或將其作為母株之變異株、或者如請求項4或5之轉形體。
    [11] 如請求項9之D-苯基乳酸或D-4-羥基苯基乳酸之製造方法，其中上述微生物基質為選自D-葡萄糖、L-苯丙胺酸、L-酪胺酸、苯丙酮酸及4-羥基苯丙酮酸中之1種以上之基質。
    [12] 如請求項10之D-苯基乳酸或D-4-羥基苯基乳酸之製造方法，其中威克酵母屬酵母為螢光威克酵母。
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    2019-06-21| MM4A| Annulment or lapse of patent due to non-payment of fees|
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    JP2011018895||2011-01-31||
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